Лабораторний журнал - Методи - Оптимізоване середовище культури клітин
Міря Краузе
Виробництво розчинних рекомбінантних білків у бактеріальних клітинах не завжди працює гладко. Міря Краузе пояснює, як нещодавно розроблена система культури клітин En Base може значно збільшити щільність клітин і кількість розчинного білка на клітину.
В основному завдання клітинних культур, які використовуються для експресії рекомбінантних білків, дуже прості: вони повинні виробляти максимально активні розчинні білки. Однак у багатьох стандартних протоколах культури клітин це працює лише частково або іноді взагалі не працює. Найвідомішим протоколом культивування клітин кишкової палички в колбах для струшування є, мабуть, протокол Самбрука, який зазначений у «Біблії молекулярної біології» Тома Маніатіса. Понад 20 років молекулярні біологи використовували цей протокол як керівництво, яке часто працює - але не завжди.
Білки, які можуть виражатися погано або взагалі не виражатися за допомогою Самбрука або іншого стандартного протоколу, зазвичай розглядаються як "важкі кандидати", які вимагають особливих хитрощів. Ці випадки також траплялися в нашій робочій групі, і ми часто шукали смужки експресованого білка в гелях SDS-PAGE за допомогою лупи.
Переїдені бактерії
Причиною поганого врожаю в експресії білків у бактеріальних культурах часто є явище, яке трапляється і у людей: бактерії просто переїдають. Середовища для культур струшування зазвичай “працюють” як періодичні культури і містять усі компоненти та поживні речовини для подальшого вирощування з першої секунди. Процес переважно неконтрольований, тобто такі важливі параметри, як значення рН, кількість розчиненого кисню та концентрація глюкози в середовищі не контролюються.
Як результат, швидкість дихання швидкозростаючих бактерій перевищує швидкість перенесення кисню в культуру. Це швидко призводить до виснаження кисню і, отже, до обмеження росту. Зараз бактерії ростуть повільно і зменшують вироблення білка. Вони пристосовують свій метаболізм до умов анаеробної культури і виділяють метаболіти, що знижують значення рН. Крім того, неконтрольована кількість глюкози, присутньої у стандартних складних середовищах, призводить до надлишкового обміну речовин. Це призводить до накопичення додаткового ацетату, який ще більше знижує рН живильного середовища, поки переїдаючі бактерії остаточно не «захворіють».
Все це посилюється, коли колби для струшування - як це зазвичай буває в багатьох лабораторіях - закриваються бавовняними пробками, алюмінієвою фольгою або металевими ковпачками. Перенесення кисню в культури зменшується до нуля, а перехід до анаеробних, тобто несприятливих умов культури, прискорюється. Рішення для транспортування кисню в колби пропонують самоклеючі стерильні одноразові герметизуючі мембрани, так звані AirOtop Seals. Мембрани AirOtop не пропускають в культуру зовнішні мікроби, крім кисню. Проблема переїдання, описана вище, все ще залишається.
Для того, щоб підтримувати клітини здоровими, ферментаційні реактори використовують так званий пакетний процес для безперервного перекачування певної кількості глюкози в реактор. Одночасно датчики контролюють значення рН та вміст кисню. Таким чином можна досягти дуже високої щільності клітин і збільшити продукцію розчинних рекомбінантних білків.
Але як можна перенести принцип подачі партії з біореакторів на струшування колб або мікротитрувальних пластин? Зовсім просто: поставивши бактерії на "цукрову дієту".
Середній з Фінляндії
Кілька років тому група Пітера Нойбауера в Університеті Оулу у Фінляндії розробила систему клітинної культури EnBase (ферментативна субстрат-доставка), яка контролює викид глюкози в середовище шляхом ферментативного перетравлення крохмалю (Panula-Perälä et al., Microbial Cell Factories 2008, 7:31). Тим часом інженер біопроцесу Нойбауер переїхав з крайньої півночі до ТУ Берлін і створив ще одну середовище під назвою EnBase Flo зі своєю командою, що містить полімери, що вивільняють глюкозу, у розчинній формі.
Цукрова дієта
За допомогою EnBase Flo кількість глюкози в середовищі можна контролювати за допомогою концентрації ферменту (глюкоамілази), встановленої в культурі (Krause et al., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). Цукрова дієта запобігає шкідливому надлишку метаболізму в бактеріях і гарантує, що значення рН залишається стабільним протягом більше двох днів і, отже, значно довше, ніж у середовищі LB, в якому значення рН постійне протягом шести-восьми годин. Так звані бустер-таблетки додатково посилюють рН-стабілізуючий ефект. Бактерії залишаються здоровими і можуть культивуватися в контрольованих і стабільних умовах, в яких вони досягають значно більшої щільності клітин. Крім того, вихід розчинного активного білка збільшується до десяти разів. Тим часом, середовище EnBase Flo, яке підходить не тільки для лабораторних масштабів, але і для процесів з високою пропускною здатністю, також доступне у форматі таблеток під назвою EnPresso, що робить вирощування ще простішим.
Наступний короткий протокол ілюструє, наскільки проста культура клітин із системою EnBaseFlo. Вам потрібні: стерильна колба об’ємом 500 мл, стерильна вода, антибіотики, індуктор та набір таблеток еспресо. Першим кроком є підготовка докультурної культури. Це може бути посіяно з рідкої культури протягом ночі, гліцеринової палички або з агарової пластини. Потім у стерильних умовах додайте 50 мл стерильної води та дві середні таблетки в 500-мл колбу, почекайте, поки таблетки розчиняться, а потім додайте необхідний антибіотик і 50 мкл EnZ’Im (глюкоамілази). Потім попередню культуру інокулюють (OD 600 = 0,05-0,15), колбу закривають мембраною AirOtop і починають культивування. Після культивування протягом ночі (16-20 годин) додають підсилювальну таблетку, 50 мкл EnZ’Im та індуктор. Потім культивування продовжують, і клітини збирають через 24 години.
Останні зміни: 23.02.2011