Масштабна реконструкція дефектів за допомогою нового гібридного каркасу з полі

предметів

реферат

вступ

Кісткові дефекти критичного розміру - це загальне клінічне захворювання, яке, як правило, спричинене травмою, захворюванням кісток або резекцією пухлини 1. Внаслідок цього втрата кісткової маси не може бути фізіологічно відновлена, і зазвичай потрібна велика кількість регенерації кісток 2. Кісткові трансплантати, такі як аутотрансплантати та алотрансплантати, широко використовуються для індукції та збільшення кісток при великих дефектах кістки 3. Однак ці кісткові трансплантати мають деякі обмеження, які роблять синтетичні замінники кісткових трансплантатів привабливою альтернативою 4, 5 .

Результати

Характеристика каркасів PLLA/nHA/CM-AL

Морфологія та пористість каркаса

Морфологічні особливості риштування були візуалізовані за допомогою світлової мікроскопії та SEM, як показано на фіг. Аналіз поперечного перерізу каркасів під світловою мікроскопією показав, що фотичні зони та CH/nHA-AL (коричневий) були рівномірно розподілені в каркасах (фіг. 1А). У рамках СЕМ каркаси демонстрували однорідну зв’язану пористу структуру з діаметром пор 150–250 мкм. Морфологія будівельних лісів сильно відрізнялася між двома лісами (PLLA/nHA та CM-AL), причому CH/nHA-AL частково вбудовані в будівельні ліси CM-AL (1A).

Властивості каркасів CM-AL, що містять різні концентрації CH/nHA-AL. ( А. ) Морфологія каркасів CM-AL (0%), CM-AL (10%) та CM-AL (20%) під світловою мікроскопією (LM) та скануючою електронною мікроскопією (SEM); ( B. ) Пористість каркасів CM-AL з різним вмістом CH/nHA-AL; ( C. ) Міцність на стиск і модуль каркасів CM-AL з різним вмістом CM-AL; ( Д. ) Тестування вивільнення препарату in vitro на лісах CM-AL протягом 25 днів з використанням скелетів CH/nHA-AL та PLLA/nHA/AL в якості контролю. Чорна стрілка позначає матрицю PLLA/nHA, а біла стрілка - мікросфери CH/nHA-AL. * стор

Деградація in vitro каркасів CM-AL з різним вмістом CH/nHA-AL під час 12-тижневого спостереження. ( А. ) Морфологічні зміни на риштуваннях, що спостерігаються в рамках СЕМ; ( B. ) рН середовища деградації підготовлених лісів із збільшенням часу інкубації; ( C. ) Втрата маси риштування під час демонтажу. Біла стрілка позначає мікросфери CH/nHA-AL. * стор

Цитосумісність ешафотів CM-ALs in vitro. ( А. ) Морфологія клітин та адгезія кроликів ASC на риштуваннях під SEM; ( B. ) Аналіз цитотоксичності АСК, що вижили під вилуговуванням на ешафотах, за допомогою аналізу МТТ; ( C. ) Активність АСК у лужному фосфаті (ALP) у вимивній рідині риштування; ( Д. ) Синтез мінералізованої матриці аналізували на відкладення кальцію фарбуванням червоним азазарином. Біла стрілка позначає мікросфери CH/nHA-AL. * p # p

Рентгенологічний аналіз регенерації кісток у різний час після імплантації. ( А. ) Репрезентативні рентгенограми регенерації кістки в різний час. У контрольній групі спостерігалося нове утворення кісток, але дефект кістки не був відновлений; У групі аутотрансплантатів аутологічний ортотопічний трансплантат дозволив повністю загоїти дефекти променевої кістки протягом 8 тижнів спостереження; У групі імплантатів CM-AL (0%) було очевидним утворення нових кісток на 8 тижні. Лінії переломів кісток майже не спостерігались, в той час як зшивання порожнин кісткового мозку не виявлено. У імплантованій групі CM-AL (10%) дефекти кісток заживали новим утворенням кісток протягом 4 - 8 тижнів. ( B. ) Напівкількісний аналіз показав значне утворення нових кісток у CM-AL (10%) - імплантована група порівняно з CM-AL (0%) - імплантована група, і дані збільшувались з часом. * стор

Гістологічний аналіз регенерації кісток та деградації ешафотів у різний час після імплантації. ( А. ) Фарбування ВІН показує невелику кількість новоутворених трабекул через 2 тижні як у групах CM-AL (0%), так і CM-AL (10%). Через 4 і 8 тижнів були представлені грубі кісткові трабекули, які згруповані з добре помітною судинною структурою. Фіброзний дефект, заповнений тканиною, все ще був помітний у групі CM-AL (0%), тоді як він був менш помітний у групі CM-AL (10%). ( B. ) Кількісний аналіз показав збільшення нової площі кісток з включеними CM-AL та збільшення днів. Білі стрілки позначають ділянки формування нових кісток, тоді як чорні стрілки позначають каркас (збільшення: × 40). * стор

Забарвлення Массона показало поступове дозрівання новоутвореної кістки в обох групах. Новоутворену кістку забарвлювали в синій синій колір (як показує біла стрілка) на 2-му тижні, а синя область поступово зменшувалась, коли кістка дозрівала на 8-му тижні, вказуючи на те, що остеогенез розпочався в обох групах вже на 2-му тижні однак процес остеогенезу тривав довше у групі CM-AL (10%), ніж у групі CM-AL (0%) (збільшення: × 40).

обговорення

Аналіз деградації in vitro показав підвищену деградацію каркасів CM-AL із збільшеним вмістом CH/nHA-AL, і не було значної різниці деградації між лесами CM-AL (10%) та контролем PLLA/nHA. Коливання рН під час деградації in vitro пористих каркасів CM-AL було менше, ніж у каркасів PLLA/nHA, що свідчить про деградацію як матриці PLLA, так і CM. Тим часом коефіцієнт втрати ваги у будівельних лісах CM-AL був значно збільшений, тоді як механічні властивості були значно нижчими. Ці результати узгоджувалися з попереднім дослідженням, яке показало, що втрата ваги композитів на основі PLLA зростає із збільшенням дозування СМ, і це пояснюється переважним розчиненням компоненту хітозану в композитах 41. Існує припущення, що швидка деградація введених СМ сприяє втраті ваги будівельних лісів на ранній фазі 37. Загалом, наші результати показали докази того, що підмостки PLLA/nHA з 10% CH/nHA-AL мали переважні властивості, тоді як збільшення вмісту CH/nHA-AL до 20% спричинило несприятливий ефект. Тому в подальших дослідженнях використовувались каркаси PLLA/nHA з 10% CH/nHA-AL.

Однак це дослідження також має деякі обмеження. Молібденову синю колориметрію в основному застосовували для визначення концентрації AL на основі фосфатного аніона у воді. Хоча метод виявився відтворюваним, точним та придатним для визначення AL 33, 48. Однак замість PBS використовували дистильовану воду, яка імітує постійний рН рідини тіла, оскільки велика кількість фосфату з PBS може перешкоджати визначенню AL. Отже, інші методи, які можуть краще імітувати стан рідини в організмі, можуть бути розглянуті для визначення АЛ у нашій подальшій роботі.

На закінчення, мікросфери CH/nHA, інкапсульовані AL, були успішно вбудовані в ешалони на основі PLLA/nHA та розроблена система доставки на основі мікросфери для доставки AL та інженерії кісткової тканини. Скелі CM-AL (10%) показали більш стійке вивільнення ліків та порівнянні механічні та деградаційні властивості. Остеогенна диференціація ASC також була посилена, про що свідчить суттєво підвищена активність ALP та відкладення кальцію. Дослідження in vivo показали відмінне загоєння кісток від ешафотів CM-AL (10%), порівнянні з результатами аутотрансплантації. Тому результати цього дослідження свідчать про перспективне застосування каркасів CM-AL (10%) для доставки ліків та інженерії кісткової тканини.

матеріал і методи

Виробництво PLLA

PLLA виготовляли за допомогою кільцевої полімеризації лактиду. Коротше кажучи, L-лактидний мономер (90%, Jiangxi Wuzangye Biochemical Industry Co., Ltd., Шанхай, Китай) дегідратували при 140-150 ° C протягом 4-5 годин, з наступною декомпресійною дегідратацією при 2,5 до 8,0 кПа та 170 ° C протягом 6-8 год. Продукти деполімеризували до лактиду у присутності октоату олова (0,27 кПа, 37 ° С). Лактид очищали повторною перекристалізацією з використанням етилацетату в якості розчинника. Полімеризацію з розкриттям кільця проводили для отримання PLLA у присутності лактиду та октоату олова як ініціатора та каталізатора (8000: 1). Сополімер PLLA характеризувався гельпроникаючою хроматографією (GPC) та інфрачервоною спектроскопією з перетворенням Фур'є, як описано раніше 49.

Виробництво пористих каркасів CM-AL

Схематичне зображення виробництва лісів PLLA/nHA/CM-AL для регенерації кісток на моделі кролика з великими сегментарними дефектами кістки.

Характеристика каркасів PLLA/nHA/CM-AL

Морфологічні та пористі властивості

Морфологію лісів PLLA/nHA/CM-AL візуалізували за допомогою світлової мікроскопії (Olympus U-RFL-T, Токіо, Японія) та скануючої електронної мікроскопії (SEM, Nova NanoSEM230, США). Пористість будівельних лісів вимірювали за принципом Архімеда, як описано раніше 51. Коротше кажучи, каркаси були поміщені у мірний циліндр, який був заповнений певною кількістю етанолу (V1). Реєструвались загальний об’єм після занурення в риштування (V2) та об’єм етанолу, який залишався у балоні (V3) після видалення риштування. Потім пористість визначали, використовуючи таке рівняння:

Механічні властивості

Каркаси довжиною 20 ± 0,7 мм і шириною 7 ± 0,5 мм виготовляли і сушили у вакуумі протягом 24 годин. Механічні властивості вимірювали за допомогою універсальної механічної випробувальної машини Instron 1121 при кімнатній температурі зі швидкістю навантаження 1,0 мм/хв та механічною деформацією 2 мм. Модуль стиснення розраховували за допомогою динамічного тестера модуля пружності DTM-II (Xiangyi Instruments Co., Ltd., Xiangyi, Китай). Для кожного зразка тестували три зразки.

Доставка препарату in vitro

Вивільнення препарату in vitro вимірювали згідно з попередньою методикою з деякими модифікаціями 33. Коротко кажучи, кожну риштування поміщали в діалізний мішок, занурений у дистильовану воду (40 мл), і струшували протягом 25 днів при 37 ° C і швидкості 45 об/хв. Супернатант (2 мл) збирали щодня та кількісно визначали за допомогою колориметричного аналізу молібденового синього.

Деградація in vitro

Прямокутні зразки риштування занурювали у розчин фосфатного буфера (PBS) та контролювали за зміною рН та коефіцієнтом втрати ваги. РН вимірювали один раз на тиждень протягом 16 тижнів. Втрата ваги будівельних лісів відзначалася кожні 4 тижні після вакуумної сушки під час демонтажу. Для кожного часового пункту було зроблено три зразки з кожного лісу.

Тест на біосумісність in vitro

Клітинна морфологія та аналіз адгезії

Ліси культивували разом із стовбуровими клітинами, отриманими з кролячого жиру (ASCs, Cyagen Biosciences Inc., Гуанчжоу, Китай) для аналізу клітинної морфології та адгезії. Ліси розрізали на невеликі шматочки (7 мм х 7 мм х 1 мм) і стерилізували за допомогою низькотемпературної плазмової стерилізації. ASC (1 × 10 4 клітин/мл, 100 мкл) висівали на риштування і інкубували протягом 2 годин в інкубаторі при 37 ° C, щоб забезпечити прикріплення клітин. Потім додавали 2 мл модифікованого середовища орел Дульбекко (DMEM), доповненого 10% фетальною бичачою сироваткою для підтримання гідратації. На 2-й та 5-й дні культури, посіви клітин виймали і ретельно промивали тричі PBS. Потім клітини на помості знерухомлювали 4% формальдегідом та тетроксидом осмію протягом 15-30 хвилин при 4 ° C і ретельно промивали 3 рази PBS. Потім зразки послідовно зневоднювали серією етанолу (50, 70, 90, 95 та 100%) двічі протягом 10 хвилин кожного разу. Зразкам давали висохнути у критичній точці та покривали золотом для SEM-аналізу клітинної морфології та адгезії.

Тест на цитотоксичність in vitro

Пластини з риштуваннями площею 100 мг (14 пластин, 7 мм × 7 мм × 1 мм/плита) стерилізували і занурювали в 20 мл середовища при 4 ° С на 48 годин. Кроличі ASC (5 × 10 4 клітин/мл, 100 мкл) висівали в 96-лункові планшети і культивували в інкубаторі при 37 ° С протягом 48 годин, а потім середовище оновлювали. Розчин МТТ (1 мг/мл, 100 мкл, Sigma-Aldrich) додавали в кожну лунку в дні 1, 3 і 5 та інкубували протягом 4 годин при 37 ° С. Після видалення супернатантів додавали 150 мкл. l Диметилсульфоксид (ДМСО, Sigma-Aldrich), доданий для розчинення кристалів блакитного формазану. Поглинання вимірювали при 490 нм за допомогою зчитувача ELISA (Bio-Tek Instruments, Inc., Highland Park, VT, USA).

Остеогенна диференціація in vitro

Остеогенний ефект лісів PLLA/nHA/CM-AL in vitro аналізували за допомогою аналізу активності лужної фосфатази (ALP) та фарбування червоним азазарином. Кроличі ASC (5 х 10 4 клітин/мл, 120 мкл/лунка) висівали в 12-лункову тарілку, що містить вилучені рідини з риштування з остеогенним середовищем або без нього (OGM, DMEM, 10% FBS, 100 нмоль/л дексаметазону). 0,05 ммоль/л аскорбінової кислоти та 10 ммоль/л & bgr; -Гліцерофосфат). Активність ALP вимірювали на 7 та 14 день, як описано раніше 31. Для фарбування алізариновим червоним середовище змінювали кожні 3 дні. Клітини отримували на 7 і 14 день і фіксували в 4% формальдегіді протягом 15 хвилин. Після двічі промивання PBS зразки обробляли алізариновим червоним (0,5 мл, 40 ммоль/л, pH = 4,1) протягом 25 хв. Потім знімки були зроблені під перевернутим оптичним мікроскопом (Nikon, Токіо, Японія). Відсоток позитивних клітин розраховували з принаймні 3 випадково вибраних полів.

Регенерація кісток in vivo

Статистичний аналіз

Дані були виражені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Експерименти проводились у трьох примірниках. Статистичне порівняння проводили за допомогою t-критерію Стьюдента або одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA), якщо це доречно. Значення Р менше 0,05 вважали статистично значущими.

день подяки

Ця робота була підтримана Національним фондом природничих наук Китаю (грант № 81371934, № 81501860 та № 31470948) та частково профінансована Радою з питань стипендій Китаю (грант № 201506370173).

Зауваження

Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь з нашими умовами використання та правилами спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.