Методи; активація іонів у клітині ICR
Методи активації
На додаток до класичного методу активації ІД в гексаполярному зіткненні, FTICR пропонує велику кількість режимів активації, які можуть (i) призвести до "повільного нагрівання" іона-попередника (IRMPD, SORI -CID та BIRD), який призводить до утворення іонів шляхом зниження енергії або (ii) призводить до «неергодичного» розкладання внаслідок хімічних процесів шляхом захоплення або відшарування електронів (ECD, EDD).
Активації зіткнення
1.1 Дисоціація низької енергії в клітині зіткнення
Згадаймо тут, що дисоціація у зовнішній камері зіткнення має багато переваг. По-перше, значне збільшення динамічного діапазону приладу. Таким чином, можна відібрати іон меншості, і він сам і його утворені іони передаватимуться в клітину ICR. Крім того, такий спосіб дисоціації дозволяє уникнути необхідності вводити в клітину газ активації, що призведе до зменшення роздільної здатності.
Основним недоліком цього режиму є можливе існування ефекту часу прольоту під час передачі іонів до клітини ICR, що може призвести до розрізнення кількості йонів відповідно до їх співвідношення m/z.
2 Активація зіткнення з низькою енергією шляхом резонансного збудження або "майже"
250 - 500 мс), тому дисоціація може стати більш ефективною.
| в) | б) |
| Малюнок 1. (в) Ліворуч еволюція циклотронного радіуса іонів як функція часу () Справа - фазовий зсув резонансної частоти по відношенню до частоти іонів. | |
Чотири основні параметри визначають ефективність дроблення в режимі SORI-CID: зсув частоти, амплітуда збудження, час збудження та тиск газу. [3], [4] Частоту зміщення та амплітуду слід оптимізувати для кожного експерименту, щоб отримати задовільний ступінь фрагментації. Чим менша частота зміщення, тим швидше накопичується внутрішня енергія іона-попередника, тому константа швидкості фрагментації збільшується. Оскільки режим SORI-CID є селективним для іона-попередника, утворені іони не можуть бути активовані, коли вони не мають однакову частоту. Послідовні іони, які можна спостерігати, зумовлені надлишком енергії, що передається іону-попереднику.
Недоліком режимів SORI-CID та RE-CID є тривалість часу аналізу порівняно з іншими методами активації, такими як IRMPD (порожня інфрачервона область). Дійсно, газ, що вводиться в клітинку ICR для зіткнень та фрагментації іона попередника, спричиняє збільшення тиску майже до 10 -6 мбар (замість 10 -10 мбар). В результаті чутливість та роздільна здатність сильно погіршуються. Крім того, цей високий тиск може призвести до спотворення ізотопної маси. Тому після етапу активації необхідно дотримуватись часу накачування, необхідного для отримання знову досить низького вакууму (порядку декількох секунд для досягнення вакууму 10 -9 -10 -10 мбар), перш ніж d '' виконати виявлення крок, оскільки бажано мати довший перехідний сигнал. Малюнок2 демонструє різні кроки для експерименту SORI-CID.
| Малюнок 2. Послідовність аналізу для отримання спектру SORI-CID (документація Bruker) |
Активації фотонів: IRMPD та ПТИЦА
2.1 IRMPD
Спосіб IRMPD був спочатку розроблений у випадку ICR для структурної характеристики молекул із низьким співвідношенням m/z. [5] У 1990-ті роки McLafferty та співавт. продемонстрував інтерес до вивчення пептидів, білків, олігонуклеотидів та олігосахаридів. З тих пір цей спосіб активації став дуже корисним інструментом для вивчення структури біомолекул.
IRMPD складається з дисоціації, спричиненої поглинанням інфрачервоних фотонів, англійською мовою InfraRed MultiPhoton Dissociation. Іон попередника опромінюється в клітині ICR ІЧ-лазером CO2 (λmax = 10,6 мкм) безперервно. Тривалість лазерного імпульсу та потужність променя, виміряні у відсотках від максимального значення, є двома основними параметрами для контролю, оскільки вони контролюють константу швидкості іона попередника. Отримання спектру MS/MS в режимі IRMPD здійснюється в кілька послідовних етапів, зведених у Малюнок 3.
| Малюнок 3. Послідовність аналізу для отримання спектру IRMPD (документація Bruker). |
Режим активації IRMPD має перевагу порівняно з режимом SORI-CID у тому, що не вимагає введення газу. Таким чином, роздільна здатність зберігається порівняно з режимом SORI-CID. Крім того, цикл аналізу коротший. Однак цей режим опромінення лазером не є селективним щодо іона-попередника, на відміну від режиму SORI-CID. Дійсно, усі іони, траєкторія яких накладається на інфрачервоний промінь, можуть бути активовані однаково. Іони продукту, що утворюються під час дисоціації іона-попередника, продовжують зазнавати цю активацію, що призводить до численних послідовних фрагментацій. І навпаки, іони, що розвиваються на орбіті, більшій за пучок ІЧ-лазера, не можуть активуватися. Це часто трапляється, коли застосовується підхід до пастки. Оскільки такий підхід дозволяє модифікувати рух магнетронів іонів і може викликати занадто великий радіус магнетрона (Малюнок4а). Для вирішення цієї проблеми можна використовувати радіочастотний імпульс для підвищення ефективності дисоціації (Малюнок4б).
Малюнок 4. Поєднання руху магнетронів та циклотронного руху набору іонів, що має орбіту більшу, ніж лазерний промінь, після застосування бокового удару: (в) без застосування радіочастотного імпульсу іони не опромінюються, () після застосування радіочастотного імпульсу іони опромінюються. [6]
2 ПТИЦЯ
Подібно до IRMPD, режим BIRD [7] (інфрачервона дисоціація чорного тіла) передбачає активацію іона попередника шляхом накопичення енергії, що передається інфрачервоним випромінюванням. Інфрачервоні фотони випромінюються зі стінок клітини ICR при її термічному нагріванні. Цей спосіб активації призводить до розкладання, подібного до тих, що спостерігаються в рамках IRMPD або SORI, але в основному він використовується для визначення енергій активацій для розриву ковалентних зв'язків чи ні. [8] Дійсно, завдяки високому вакууму, який існує в клітині FT-ICR, цей режим дисоціації передбачає постійний обмін енергією між захопленими іонами та їх оточенням через поглинання та випромінювання інфрачервоних фотонів. Таким чином, коли вакуум є досить високим (-6 мбар), обмін енергією при зіткненні із залишковим газом стає незначним порівняно з поглинанням та випромінюванням ІЧ-фотонів, і це протягом відносно тривалого часу спостереження (кілька секунд). Таким чином, можна застосувати закон Арреніуса та оцінити для даного процесу дисоціації енергію активації Ea, а також доекспоненціальний фактор A. 8
| Рівняння 1 |
3 Хімічні активації: ECD, EDD та ETD
3.1 ECD
Дисоціація електронного захоплення (ECD) [9] показала свій потенціал для структурного вивчення біополімерів. Несправність! Закладка не визначена. Позитивні багатозаряджені іони-попередники бомбардуються електронами з низькою кінетичною енергією (9 Наприклад, у випадку пептидів, іони фрагментів типу c і z • (або c • і z) отримують за допомогою ECD [10] замість звичайних b і y іони (згідно з номенклатурою Рєпсторфа [11]), як правило, спостерігаються за допомогою режимів вібраційної активації, таких як CID або IRMPD. Зокрема, було показано, що ECD дозволяє дисоціювати пептидний кістяк, зберігаючи лабільні групи, такі як фосфати або цукри. Малюнок 5, у випадку глікозильованого пептиду, режим IRMPD в основному призводить до фрагментації олігосахариду, тоді як режим ECD призводить до розщеплення основи пептиду. Його основними додатками є: i) послідовність послідовностей білків de-novo, [12] ii) локалізація місць посттрансляційної модифікації. [13]
| Малюнок 5. Фрагментація іона [M + 3H] 3+ глікопептиду, що утворюється під електророзпиленням шляхом (в) IRMPD та () ECD. [14] |
Механізми, що беруть участь у дисоціації захоплення електронів, все ще є предметом вивчення та дискусії [15]. Радікальний катіон утворюється екзотермічною іонно-електронною рекомбінацією, яка швидко розкладається. У початковому механізмі електрон захоплюється сайтом протонування, який у випадку пептидів часто є бічним ланцюгом лізину або аргініну. Приєднання електрона призводить до утворення нестійкого радикала, який дисоціює при втраті атома водню. Цей водень захоплюється карбонілом сусіднього амідного зв’язку, що веде до проміжного продукту, який дисоціює, розриваючи сусідній зв’язок N-Cα. 10 Зовсім недавно Туречек запропонував інший механізм, коли електрон захоплюється амідним зв’язком, що призводить до утворення виду, відомого як "надбаза", який захоплюватиме протон із сусідньої основної амінокислоти (Діаграма 1). 15 Цей механізм дозволяє краще врахувати відносно випадковий характер розривів, що спостерігаються вздовж пептидного скелета.
| Діаграма 1. Загальний механізм процесу ECD. 15 |
3.2 EDD
У 2001 р. Зубарев та ін. ввів режим EDD [16] (дисоціація за рахунок відшарування електронів), застосований до багатозаряджених аніонів. На відміну від EDC, іон-попередник бомбардується електронами з високою кінетичною енергією (> 10 еВ), щоб від'єднати один або кілька електронів. Таким чином, у випадку пептидів [17] окислений вид [M-2H] - • призводить головним чином до втрат СО2, а також до послідовних іонів серій a • та x, отриманих розривом зв'язку. Cα-C. Здається, що іонів a • менше, ніж іонів x. Це пояснюється нестабільною природою цих радикальних видів, які можуть швидко переставлятись та/або послідовно фрагментуватися. 17
| Діаграма 2. Запропонований механізм дисоціації за рахунок відшарування електронів. |
EDD виявив свою зацікавленість у вивченні біополімерів з кислотними функціями, зокрема на олігонуклеотиди. Було помічено, що при EDD окремі ланцюги мультидепротонованої ДНК невеликого розміру [18] призводять до окислених видів, які в деяких випадках можуть фрагментуватися до іонів послідовності w та (a-B), як це спостерігається при зіткненні активації. Однак, крім цих іонів, є іони радикалів a та z, а також іони c, (c-B), x та (x-B), які, схоже, є специфічними для цього способу фрагментації. Таким чином, здається, що додаткова структурна інформація може спостерігатися при EDD.
3.3 ETD
За принципом, близьким до ECD, була розроблена дисоціація переносу електронів або ETD (дисоціація переносу електрона). [19], [20] Замість бомбардування електронами вводиться негативно заряджений хімічний реагент-донор електронів, який реагує з фрагментованими видами. [21] Отже, це іон/іонна взаємодія між іоном-попередником та хімічним реагентом, з яким відбувається передача електронів, щоб отримати дисоціацію. У цьому випадку вибір реагенту видається важливим. Наприклад, у початковій роботі Ханта антрацен був іонізований у хімічному джерелі іонізації у присутності метану з утворенням реакційноздатних іонів C14H11. Маклюкі використовував 21 нітробензольний аніон або азобензольні радикальні аніони. Сьогодні флуорантен часто використовується на комерційних машинах, де впроваджено ETD. 19, [22] Слід зазначити, що ETD також успішно застосовується для дисоціації багатодепротонованих видів способом, аналогічним EDD. [23] Таким чином, ETD є методикою, яка застосовується як до позитивних, так і до негативних іонів із використанням різних реагентів, але його застосування як інструменту FT-ICR ще належить розробити.
[1] Cody R.B., Burnier R.C., Freiser B.S . Індукована зіткненнями дисоціація з мас-спектрометрією перетворення Фур'є. Анальний Хім. 1982 рік, 54, 96.
[2] Готьє Дж. В., Траутман Т. Р., Якобсон Д. Б . Стійке позарезонансне опромінення для активації зіткнення дисоціації за участю мас-спектрометрії перетворення Фур’є. Техніка дисоціації, що активується зіткненнями, яка імітує інфрачервону багатофотонну дисоціацію. Анальний Чим. Acta. 1991 рік, 246, 211.
[3] Ласкін, Дж., Берд, М., Футрелл, Дж. Внутрішні розподіли енергії, що виникають внаслідок стійкого позарезонансного збудження в FTMS. I. Фрагментація катіона радикалу бромбензолу. Міжнародний J. Mass Spectrom. 2000 рік, 196, 285.
[4] Горшков, М. В., Паса-Толік, Л., Сміт, Р. Д. . Витримане нерезонансне опромінення з обмеженим тиском для зіткненої активованої дисоціації в мас-спектрометрії з перетворенням Фур'є. J. Am. Soc. Мас-спектром. 1999 рік, 10, 15.
[5] Woodlin R.L., Bomse D.S., Beauchamp J.L . Багатофотонна дисоціація молекул з інфрачервоним лазерним випромінюванням безперервної хвилі малої потужності. J. Am. Chem. Поділіться. 1978 рік, 100, 3248.
[6] Хофстадлер С. А., Саннес-Лоурі К. А., Гріффі Р. Х . m/z-селективна інфрачервона багатофотонна дисоціація в пастці Пеннінга з використанням ловушки сторонніх ударів та пульсу радіочастотного тиску. Швидка комунікація Мас-спектром. 2001 рік, 15, 945.
[7] Dunbar R.C . BIRD (Чорна інфрачервона радіаційна дисоціація): еволюція, принципи та застосування. Мас-спектром. Преподобний. 2004 рік, 23, 127.
[8] Strittmatter E.F., Schnier P.D., Klassen J.S., Williams E.R . Енергії дисоціації димерних аніонів дезоксирибозного нуклеотиду, виміряні за допомогою інфрачервоної радіаційної дисоціації чорних тіл. J. Am. Soc. Мас-спектром. 1999 рік, 10, 1095.
[9] Зубарев Р.А., Келлехер Н.Л., Маклафферті Ф.В . Електронна захоплююча дисоціація багатозарядних катіонів білка. Неергодичний процес. J. Am. Chem. Поділіться. 1998 рік, 120, 3265.
[10] Зубарев Р.А., Хасельманн К.Ф., Будник Б.А., Кельдсен Ф., Йенсен Ф. До розуміння механізму дисоціації захоплення електронів: історична перспектива та сучасні ідеї. Євро. J. Mass Spectrom. 2002 рік, 8, 337.
[11] Roepstorff P., Fohlman J . Пропозиція загальної номенклатури послідовних іонів у мас-спектрах пептидів. Біомед. Мас-спектром. 1984 рік, 11, 601.