Модель культури позаклітинного матриксу людини-адипоцитів для вивчення метаболізму матриксних клітин

Резюме

Ми описуємо 3D-систему позаклітинного матриксу-адипоцитів людини in-vitro в культурі, яка дозволяє розбити ролі матриксу та адипоцитів у кодифікації метаболічного фенотипу жирової тканини.

Анотація

Вступ

Позаклітинний матрикс (ЕКМ) не тільки забезпечує механічну основу для тканини, але також втручається в складну перехресну розмову з клітинами, які в ній перебувають, і регулює різні процеси, необхідні для гомеостазу тканин, включаючи проліферацію, диференціацію клітин, Сигналізація та метаболізм 1. Хоча здоровий ECM відіграє важливу роль у підтримці нормальної функції тканин, дисфункціональний ECM пов'язаний з декількома захворюваннями 2 .

Жирова тканина відіграє важливу роль у патогенезі метаболічних захворювань. Ожиріння пов’язане з надмірною гіпертрофією адипоцитів та клітинною гіпоксією, дефектами метаболізму клітин адипоцитів та жирової тканини, більшою кількістю ендоплазматичної сітки, окислювальним стресом та запаленням. Хоча вони погано вивчені, ці складні процеси змовляються компрометувати буферну здатність жирової тканини, що призводить до переливу поживних речовин з жирової тканини, токсичності багатотканини та системних метаболічних захворювань 3, 4, 5. Послідовність подій та специфічні механізми, що лежать в основі відмови жирової тканини, недостатньо вивчені, але були задіяні зміни в ЕКМ жирової тканини. Склад ECM змінюється в жировій тканині при ожирінні людини та мишей, збільшується відкладення білка ECM поряд з якісними біохімічними та структурними відмінностями в жировій тканині ECM, пов’язаних із захворюваннями метаболізму людини, включаючи діабет 2 типу та гіперліпідемію 6, 7, 8, 9, 10, 11 .

Незважаючи на ці спостереження, роль ЕСМ жирової тканини в опосередкуванні дисфункції жирової тканини недостатньо чітко визначена. Частково це пов’язано з відсутністю надійних експериментальних моделей, які дозволяють розбити конкретні ролі ECM та адипоцитів у регулюванні кінцевої жирової функції. Культура адипоцитів ECM імітує середовище in vivo самородної жирової тканини принаймні у двох точках. По-перше, культура ECM забезпечує молекулярне середовище, подібне до самородної жирової тканини, включаючи природні колагени, еластини та інші білки матриці, яких бракує у стандартній 2D культурі. По-друге, було показано, що культура на 2D пластиці змінює метаболізм адипоцитів завдяки механічним впливам через знижену еластичність пластикової основи 12, що усуває культуру ECM.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Тканини з ожирінням закуповуються у людей, які перебувають на баріатричній хірургії за вибором, за схваленням інституційної комісії з огляду.

1. Виділення преадипоцитів та підготовка культурального реагенту

  1. Приготуйте 2% бичачий сироватковий альбумін (BSA) у 1-кратному сольовому розчині, забуференному фосфатом (PBS). Стерилізуйте фільтр і зберігайте при температурі 4 ° C.
  2. Приготуйте ніс колагену II типу: 2 мг/мл у 2% BSA в 1х PBS. Підготуйте безпосередньо перед використанням.
  3. Приготуйте розчин для лізису еритроцитів: 1,5 М NH4Cl, 100 мМ NaHCO3, 10 мМ динатрієвої ЕДТА в деіонізованій воді (DI/H2O). Зберігати при 4 ° C. Приготуйте 1x розчин для лізингу еритроцитів із 10-кратного розчину для зберігання в DI/H2O безпосередньо перед використанням.
  4. Підготуйте рослинні середовища: 15% фетальної бичачої сироватки (FBS), 1% протигрибковий розчин (ABAM) у модифікованому середовищі орла Дульбекко: поживна суміш F-12 (DMEM/F12). Стерилізуйте фільтр і зберігайте при температурі 4 ° C.
  5. Приготуйте розчин для заморожування преадіпоцитів: 10% диметилсульфоксиду, 15% FBS у середовищі DMEM/F12. Стерилізуйте фільтр і зберігайте при температурі 4 ° C.
  6. Приготування середовища для диференціації: 10 мг/л трансферину, 33 'М біотину, 0,5' М розчину людського інсуліну, 17 'M D-пантотенової кислоти, хімічної солі, 100 нМ дексаметазону, 2 нМ 3,3', 5-трийод-L-тироніну натрієва сіль (T3), 1 ізобутил-1-метилксантин (IBMX), 1% ABAM в DMEM/F12. Стерилізуйте фільтр і зберігайте при температурі 4 ° C.

3. Підготовка реагенту для метаболічного фенотипування

  1. Поглинання глюкози
    1. Підготуйте сироваткове середовище для голодування: DMEM/F12, 1% ABAM. Стерилізуйте фільтр і зберігайте при температурі 4 ° C
    2. Приготуйте 200 нМ розчину людського інсуліну в 1x PBS безпосередньо перед використанням.
    3. Приготуйте 200 нМ людського інсуліну, 0,1 мМ 2-дезокси-D-глюкози, 1 Ci/лунка дезокси-D-глюкози, 2- [1,2-3 H (N)] -, у 1х PBS. Підготуйте безпосередньо перед використанням.
  2. Ліполіз
    1. Приготуйте ізопротеренол, розведений у PBS: 3 мМ вихідного розчину. Для аналізу розведіть робочу концентрацію 3 м.
  3. Масляне червоно-O забарвлення
    1. Приготуйте 4% формаліну в DI/H2O. При кімнатній температурі.
    2. Приготуйте робочий розчин Oil Red-O. Розведіть масляний розчин Red-O (ORO) з DI/H2O у співвідношенні 3: 2 (ORO: DI/H2O). Підготуйте безпосередньо перед використанням. Фільтруйте через фільтрувальний папір (Таблиця матеріалів).

4. Заготівля жирової тканини

ПРИМІТКА: Вісцеральна жирова тканина (ПДВ) видаляється хірургом з великого сальника на початку операції та транспортується назад до лабораторії на льоду для негайної обробки. Слід дотримуватися універсальних запобіжних заходів при роботі з усіма людськими тканинами та корозійними реагентами, включаючи виконання всіх робіт у ламінарному проточному капюшоні, використовуючи повний лабораторний захисний знос і без рецидиву голок.

  1. Додайте 5-10 г непошкодженого податку з продажу до 15-25 мл буферного розчину для заморожування в конічній пробірці об’ємом 50 мл, щоб занурити зразок тканини. Зберігати зразки при -80 ° C до децелюляризації до 1 місяця.
  2. Для виділення пререадипоцитів використовуйте окремий свіжий зразок чану, як описано у Розділі 5.

6. Препарат ЕКМ жирової тканини

8. Метаболічне фенотипування

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

позаклітинного
Рисунок 1: Робочий процес для підготовки адипоцитів ECM. День 1: Зразки цільної вісцеральної жирової тканини проходять три цикли заморожування-відтавання з подальшою інкубацією впродовж ночі з ферментативним розчином травлення №1. День 2: Після перетравлення ферментним розчином №1 зразки перетравлюють за допомогою ферментного розчину №2 протягом ночі. На даний момент зразки частково зневірені. День 3: Після ферментативного розщеплення №2 зразки інкубують протягом ночі з екстракційним розчином полярного розчинника, який завершує деліпідацію. Після 3-го дня зразки повинні бути повністю виснаженими та білого/напівпрозорого кольору. Зразки ретельно промивають промивним буферним розчином для промивання, потім 70% етанолом і зберігають у розчині для зберігання при температурі 40 ° C, поки їх не можна буде поповнити пресипоцитами. День 4: Преадипоцити висівають у децелюляризований ПДВ протягом 14 днів з подальшою адипогенною диференціацією. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

позаклітинного
Рисунок 2: Робочий процес ізоляції пререадипоцитів. Податок з продажу подрібнюють, перетравлюють колагеназою, фільтрують, центрифугують, а отримані гранули судинно-судинних клітин позолочують і культивують для розширення пресипоцитів. Для отримання додаткової інформації про виділення пресипоцитів людини та 2D культуру адипоцитів див. Baker et al. 2017 р. 21. Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

культури
Рисунок 3: Сканування електронно-мікроскопічних зображень. Інтактна жирова тканина, децелюляризована жирова тканина та децелюляризована жирова тканина, яку повторно заселяли препоцитами протягом 14 днів та диференціювали в адипогенних середовищах. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Опубліковані подібні методи виділення ЕКМ з жирової тканини та посіву пресипоцитами, причому дані свідчать, що ЕКМ може сприяти адипогенній диференціації без класичних адипогенних медіаторів, включаючи агоністи цАМФ. Агоністи інсуліну та PPAR 12, 14. Наші дані першими демонструють специфічну для захворювання регуляцію клітинного метаболізму за допомогою ЕКМ в жировій тканині, використовуючи методи, в яких адипоцити стимулюються класичними факторами адипогенної диференціації 11; Подібні дослідження без адипогенних подразників є метою подальших досліджень. Інші мають подібне переповнення клітин ECM, характерних для захворювання, ECM та клітинами з легеневої тканини 19, 20. Також використовувались альтернативні стратегії, включаючи створення матриць шляхом змішування гомогенізованих препаратів ECM жирової тканини в пептидних гідрогелях 12 .

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не заявляють суперечливих інтересів.