Науки про життя і Земля - Як заглушити ген
Як замовкнути ген. Втручання РНК
Одне з останніх відкриттів молекулярної біології полягає в тому, що РНК можуть регулювати експресію генів. Роками на них покладалися дві основні функції:
- Посланні РНК (мРНК) є важливими одноланцюговими (одноланцюговими) проміжними речовинами між ДНК, яка несе генетичну інформацію, та білками, які виражають цю інформацію.
- Рибосомні (рРНК) і переносні (тРНК) РНК, зі свого боку, виконують роль "декодерів" і каталізаторів цього синтезу білка в силу своєї структури. (див. загальну схему)
Ця картина дещо ускладнилася, коли вчені виявили RNAi (втручання РНК) або те, як експресія генів блокується дволанцюжковою (дволанцюжковою) молекулою РНК. З тих пір RNAi стала революційним експериментальним інструментом для розуміння ролі генів. Колишній захисний механізм геному, він бере участь у блокуванні транскрипції (синтез мРНК з ДНК) та трансляції ("зчитування" мРНК у пептид).
Відкриття
Механізм RNAi базується на простому технічному принципі: шляхом ін'єкції кількох копій дволанцюжкової РНК (дволанцюжкової або dsRNA) у хробака Cænorhabditis elegans ми блокуємо функціонування гена, послідовність якого комплементарна цій dsRNA. Як і багато великих відкриттів, дослідження РНКі базується на несподіваному експериментальному результаті.
Наприкінці 1980-х - на початку 1990-х років фізіологи рослин, які працювали над петунією, з подивом виявили, що введення кількох копій гена, що кодує колір темно-фіолетового, що далеко не покращує колір квітів, спричиняє появу білих плям на пелюстки. Досі невідомим чином введені гени (трансгени) не тільки стали німими, але й блокували власні гени рослини-господаря. Той самий результат був отриманий, коли рослини заражались генетично модифікованим вірусом, що містив лише фрагменти гена.
Ці результати не були зрозумілі до публікації роботи Fire і Mello в 1998 році: РНК-віруси розмножують свій генетичний матеріал завдяки втручанню dsRNAs, а численні копії трансгенів також викликають утворення dsRNA. Отже, явище RNAi є давнім клітинним захисним механізмом, який з’явився задовго до розбіжності від хробаків до рослин, який блокує будь-яку можливість анархічного розмноження «девіантного» генетичного матеріалу або вірусного походження, зазвичай відсутнього в клітині.
Як це працює ?
Одне з перших спостережень, яке допомогло зрозуміти механізм РНКі, полягає в тому, що рослини, гени яких замовчуються, виробляють невеликі РНК з 20-25 нуклеотидів, комплементарних заблокованим генам. Ці РНК, менші за іРНК та рибосомні РНК, довгий час залишаються невизначеними.
RNAi відновлювали in vitro з екстрактів клітин дрозофіли. По-перше, довгі дсРНК фрагментовані на менші РНК зі специфічною структурою: два ланцюги з 21 нуклеотидів, з яких 19 є дволанцюжковими, а 2 нуклеотиди неспарені на кінцях. Ці невеликі фрагменти отримали назву "коротко інтерферуюча РНК" або siРНК; навіть штучно синтезовані, вони здатні пригнічувати гени. Фермент, який розщеплює дсРНК на міРНК, називається DICER. Це ендонуклеаза сімейства III РНКаз, специфічна для dsRNAs.
Потім отримані фрагменти РНК утворюють комплекс із білками, що називаються RISC. Тут ланцюги "чуттєвих" siРНК, подібні до генів-мішеней, видаляються, залишаючи "антисмислові" ланцюги, які доповнюють один одного. Вони направляють білковий комплекс до мРНК, що виробляється геном, що призводить до його руйнування. Таким чином, ген транскрибується, але не перекладається, звідси і очевидна тиша.
Це пояснює невдачу експериментів трансгенезу в петуніях. Обидві ланцюги трансгену можна транскрибувати (замість одного ланцюга, як нормальний ген), продукуючи dsRNA замість mRNA. Потім це розрізають на кілька siРНК, які блокують цікавить ген. Чим більше копій гена, тим більше клітина його «замовчує» !
RNAi не працює таким чином для всіх організмів. Наприклад, РНК-залежна РНК-полімераза може втрутитися: вона використовує антисмисловий ланцюг siРНК як праймер для синтезу більшої кількості дсРНК, посилюючи механізм. У рослин це явище поширюється через нерепродуктивні (соматичні) тканини шляхом передачі dsRNA від клітини до клітини, створюючи продовження стійкості до вірусних інфекцій. Такий механізм малоймовірний у дрозофіли або хребетних, оскільки у них не виявлено розглянуту полімеразу.
В чому справа ?
Невеликі заважаючі РНК або siРНК можуть відігравати роль у боротьбі з транспонтованими елементами, генами, що повторюються (включаючи трансгени) та вірусами.
Транспозони, ці пустотливі "стрибаючі гени", які мають прикру звичку паразитувати ДНК, дублюючи себе, щоб вміститися де завгодно, складають майже половину генетичних послідовностей у людей. Замовчування їх є вирішальним для стабільності геному! Глисти з мутованими генами, що беруть участь у РНК, не здатні блокувати певні транспозони в зародкових тканинах (походження репродуктивних клітин). Це однаково і для рослин.
Цей механізм може також контролювати рівень експресії генів у певних тканинах. Наприклад, у дрозофіли кількість копій трансгену може змінити результат: певна кількість копій генерує сильну експресію цікавить гена, але з граничної концентрації його експресія, навпаки, зменшується. Беруть участь білки, які «обгортають» ДНК; їх структура модифікована, щоб зупинити транскрипцію. У дріжджах цей процес, який спостерігається на транспонтованих елементах, дивним чином поширюється на сусідні регіони.
РНКi: siРНК або miРНК . (див. схему)
Розкриття головної ролі siРНК розпочало дослідників у шаленому пошуку малих РНК. У жарті одного вченого ми робимо «сміття»: те, що вважалося незначним у фракціях клітин, зараз вивчається. Результат призвів до відкриття у кількох видів тварин різних малих РНК (19-25 нуклеотидів). Цей новий клас отримав назву мікроРНК або мікроРНК.
Вони кодуються геномом, але на відміну від месенджер-РНК, не призводять до виробництва білка. Фактично вони регулюють вироблення мРНК. Вони рясні, одноланцюгові, і можуть становити від кількох сотень до кількох тисяч молекул на клітину, або від 0,5 до 1% генів; у людини вони представляють від 200 до 255 генів. Вважається, що вони походять від дволанцюжкової РНК, але у вигляді «шпильки», тобто єдиної нитки, складеної назад на собі комплементарністю основи. Отже, міРНК виробляються за тим самим механізмом, який розщеплює дсРНК на міРНК, за допомогою DICER та інших ферментів. Їх спосіб дії полягає в частковому сполученні з даною мРНК, блокуючи тим самим її перетворення в білок. Відмінність від siРНК полягає в тому, що вони не зупиняють транскрипцію і мРНК не руйнуються. Крім того, siРНК націлені на гени, з яких вони отримані, тоді як miРНК, більш-менш специфічні, регулюють декілька генів, можливо, сотню і більше на миРНК. Їх ефективність також залежить від кількості молекул, приєднаних до кожної мРНК, яка дійсно містить кілька сайтів зв'язування на 3 'кінці.
У більшості випадків, як у рослин, так і у ссавців, вони беруть участь у регуляції факторів транскрипції, необхідних для розвитку. Одне з регулювань, яке здійснюють мікроРНК у нематод, визначає перехід від однієї личинкової стадії до іншої під час постембріонального розвитку. У рослин мікроРНК діють також на стадії розвитку; у дрозофіли вони контролюють поділ клітин і загибель. У людей занадто недавнє відкриття ще не дозволяє визначити їх роль; це, мабуть, головне, оскільки гени збереглися у багатьох видів під час еволюції.
Перевага цих двох молекулярних типів полягає в тому, що siРНК націлені на мРНК настільки точно, що вони ненавмисно не можуть втручатися в будь-який синтез білка, тоді як miРНК можуть діяти лише в певних концентраціях, що передбачає регуляцію їх експресії.
Давайте трохи ускладнимо.
Інші механізми, що залучають малі РНК, поступово відкриваються. Деякі специфічні siРНК, виявлені в інфузорій Tetrahymena thermophila, здатні певним чином зв'язуватися з ДНК і спричиняти її фрагментацію. Два гени, що беруть участь у цьому механізмі RNAi, були знайдені в інших видів і досі вивчаються.
Торік у C.elegans був описаний новий клас РНК із 20-22 нуклеотидів: "крихітні некодуючі РНК" або тнкРНК. Не маючи двох тісно пов'язаних взаємодоповнюючих послідовностей, вони, отже, не є шпилькою. Хоча вони вироблені DICER, вони збереглися не у всіх видів. Їх функція невідома, але багато хто, здається, доповнюють мРНК і можуть також брати участь у їх деградації.
Нарешті, цього року з нейрональних стовбурових клітин в гіпокампі дорослої миші було виділено 20-нуклеотидну некодуючу дсРНК, яка називається smARN (мала модулююча РНК). Він має ту ж послідовність, що і фрагмент ДНК від 21 до 23 нуклеотидів, який пригнічує експресію специфічних генів у нервових клітинах інших типів клітин; він зберігся під час еволюції у всіх хребетних. SmRNA в нейронах взаємодіє з регуляторними білками цього гена, сприяючи його експресії та розвитку нейронів. (див. резюме в глосарії *)
Клінічний інтерес
Недавні досягнення в галузі генетики спрямовані на виявлення відхилень, що відповідають за захворювання. Ефекти, отримані шляхом мутацій, спрямованих конкретно на ген, дають змогу зрозуміти його роль, але ця методика в основному практикується на швидко відтворюваних організмах, таких як дрозофіла. У ссавців цей трудомісткий і дорогий процес можна покращити, використовуючи RNAi.
Цей прийом порівняно простий у C.elegans: ми вводимо дсРНК у хробака або годуємо його бактеріями, які їх експресують, і спостерігаємо ефект інгібування досліджуваного гена. З 19 000 генів цієї тварини ми вже маємо банк 12 000 дсРНК. Це призвело до відкриття генів, що беруть участь у ожирінні або клітинному старінні глистів, а також в метаболізмі холестерину або формуванні серця у дрозофіли. Якщо ці гени зберігаються в процесі еволюції, ми розуміємо інтерес їх вивчення до людського виду !
Також було проведено кілька тестів in vitro на людях, але великі дсРНК вбивають наші клітини, тому в дослідженні використовуються невеликі сегменти від 21 до 22 пар основ. 8000 з 35000 людських генів вже виявили свою роль, зокрема у раку. Але це також може бути інструментом того, що малі РНК можуть виявитись грізними, наприклад, спеціально блокуючи гени, що відповідають за утворення пухлин або розповсюдження вірусів. Перспективні ефекти вже були отримані у щурів шляхом блокування вірусів гепатиту С і В, але проблема залишається у режимі введення малих дсРНК: як націлити відповідний орган ?
Збережені під час еволюції малі РНК дозволяють нам боротися проти порушень геномів або вірусних загарбників, регулюють експресію основних генів протягом усього розвитку. вважається, що вони навіть втручаються в періоди клітинного стресу, під час радикальних змін навколишнього середовища. Ці зміни в транскрипції ДНК будуть "перевірятися" цими регуляторами та вибиратися, якщо вони виявляться корисними. Немає більше сумнівів, ці маленькі молекули вийдуть із тіні, щоб затемнити "ДНК-зірку".
Від природи: т.430 - 8.07.2004 - К.Д. Новіна та П.А. Шарп: "Революція РНК".
(*) Лексикон малих РНК:
siRNA: короткі інтерферуючі РНК: Клас дволанцюжкових РНК довжиною від 21 до 22 нуклеотидів, отриманих в результаті деградації dsRNA, більшої дволанцюжкової РНК. SiRNA замовчують гени, сприяючи деградації мРНК, з якими вони специфічно пов'язуються, або залучаючи інгібуючі білки до ДНК, комплементарних їх послідовностям.
мікроРНК: мікроРНК Група з 19-25 нуклеотидів, одноланцюгових, кодованих геномом і часто збережених в процесі еволюції. МіРНК беруть участь у розвитку організмів. Вони блокують експресію генів під час синтезу білка.
тнкРНК: крихітні некодуючі РНК Новий тип від 20 до 22 нуклеотидів у C.elegans. Вони не зберігаються під час еволюції, але регулюються під час розвитку. Їх функція залишається невідомою.
smARNs: малі модулюючі РНК Невеликі модулюючі РНК, виявлені у мишей, що дозволяє експресувати гени, специфічні для дорослих нейронів.
Щоб дізнатись більше:
ARNi: http://www.nature.com/focus/rnai
Дуже приємні 3D-анімації щодо синтезу білка та RNAi, з лексиконом та можливістю їх завантаження: http: //www.nature.com/focus/rnai/animations/
Для науки:
«Антисмислові ДНК та РНК» - No 149 - березень 1990 р .;
"Поліція геному" №312 - жовтень 2003 р., Дуже чітка стаття, яка використовує ті самі ідеї, що і перекладена стаття вище про сіРНК та мікроРНК, із прикладами експериментів. Фотографії рис. 3c і d відповідають експерименту з блокуванням вірусу гепатиту С (Nature 418, 38 - 39 - 04 липня 2002 р. "Експресія генів: втручання РНК у дорослих мишей").
Доповнення:
Загальна схема, що узагальнює різні відомі ролі РНК. Рибосвічі, що спостерігаються серед інших у бактерій, є особливими РНК-ресиверами, які, залежно від їх просторової конформації, можуть або не можуть сприяти їх перетворенню в білок. Вони чимось схожі на "рибозими" або ферментативно активні РНК і регулюють власну експресію. Наведений приклад показує, як синтезується вітамін В12: за його відсутності клітина транскрибує та перекладає ген, що кодує синтетичний фермент В12. У присутності вітаміну інактивується не ген, а ген, а мРНК змінює свою конформацію і стає недоступною для рибосом. Інший метод "вимкнення" гена, не показаний тут, полягає у використанні "антисмислової" мРНК, комплементарної цільовій мРНК.