Новий метод уточнення для візуалізації дегенерації жовчовивідних шляхів під час метаморфозу печінки в морі
Резюме
Морська мінога втрачає жовчний міхур і жовчні протоки під час метаморфозу - процесу, подібного до атрезії жовчовивідних шляхів людини. Новий метод фіксації та прояснення (CLARITY) був модифікований для візуалізації всього біліарного дерева з використанням лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Цей метод забезпечує потужний інструмент для вивчення дегенерації жовчі.
Анотація
Вступ
Морська мінога розвивається через три різні життєві етапи 1,2. Личинки міног (L) проводять більше часу в норах як бентосні живильники для фільтрів. Пройшовши сім метаморфічних стадій кардинальних змін зовнішньої морфології та реорганізації внутрішніх органів 3, отримані неповнолітні (СП) переходять у паразитарну стадію, під час якої вони харчуються кров’ю та тканинними рідинами риби-господаря, l збільшення маси тіла більше 100 разів. Після 1,0-1,5 років годування рибою-господарем в океані чи великих озерах дорослі припиняють годування ранньою весною і мігрують до річок, щоб нереститися і загинути 1,2.
Під час метаморфозу печінка морської міноги втрачає жовчний міхур і все біліарне дерево, еволюційний мутантний фенотип, що імітує у дитини дитяче захворювання атрезії жовчних проток. Дитяча атрезія жовчовивідних шляхів - рідкісне дитяче захворювання печінки із серйозними медичними ускладненнями 4,5,6,7,8,9,10, але патогенез та етіологія атрезії жовчних проток в основному невідомі 4. Пацієнти з атрезією жовчних шляхів помирають протягом двох років після народження, якщо не проводиться хірургічне втручання (процедура Касая) 5. Згодом цим пацієнтам потрібне широке клінічне лікування та часто трансплантація печінки 6. Запропоновано багато теорій етіопатогенезу атрезії жовчних шляхів, таких як вірусна інфекція, вроджена вада, аутоімунне захворювання та токсичний образа. Однак внесок кожного у розвиток атрезії жовчовивідних шляхів залишається невизначеним 7,8,9,10.
На відміну від немовлят, які страждають патологічною атрезією жовчних проток, морська мінога зазнає запрограмованого розвитку атрезії жовчних проток без значного некрозапалення, фіброзу або цирозу 10. Тварини можуть відчувати перехідний холестаз під час цього процесу 10, але пристосовуються до цього стану. та секреція жовчних солей у кишечнику після розвитку атрезії жовчних шляхів, на додаток до відомих механізмів, таких як знижений синтез жовчних солей у печінці 11. Цей процес розвитку у великої морської міноги забезпечує єдину відому можливість вивчити прогресування жовчної атрезії.
Нещодавно розроблений метод, що називається "чіткість", дозволяє проводити візуалізацію з високою роздільною здатністю у складних нервових системах ссавців шляхом перетворення інтактної тканини в оптично прозорий нанопористий гідрогель 12. Використовуючи печінку морської міноги та модифікований протокол CLARITY, візуалізація тканин з інтактною дегенерацією жовчі може бути задокументована у печінці метаморфоза.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
А. Підготовка розчину
2. Підготовка тканин
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
У процесі розвитку гепатобіліарної системи під час метаморфозу морської міноги відбувається кілька важливих подій. Жовчна протока і жовчний міхур зазнають дегенеративного апоптозу (Фігура 1). Поєднання методу модифікованого освітлення та маркера фарбування печінки клітин цитокератину 19 (CK19, присутній як в холангіоцитах, так і в гепатоцитах до і після 13 метаморфозу) та антиапоптотичного маркера Bcl2 за допомогою конфокальної мікроскопії, набір жовчовивідної системи було захоплено вісь Z ( малюнок 2) і тривимірна структура була реконструйована (рисунок 3). Конфокальна лазерна скануюча мікроскопія застосовується для проведення оптичного розрізу через неушкоджену печінку, оскільки більша частина жовчовивідної системи вбудована всередину печінки, за винятком місця з'єднання, де жовчний проток потрапляє в кишечник. Дегенеративний процес відбувається на метаморфічних стадіях 2-4, від периферичних малих жовчних проток до великої центральної внутрішньопечінкової системної загальної жовчної протоки (рисунок 2), відповідно до попередніх досліджень 10.
Рисунок 2. Конфокальні зображення, що демонструють жовчне дерево в печінці морської міноги під час метаморфозу. Зразки відбирали у тварин із зовнішньою морфологією між метаморфічними фазами 2 і 3. Верхні панелі відбирали з переднього, а нижні з заднього кінця. Зображення маркера печінкової клітини цитокератин 19 (миші 1: 100 анти-CK19; фарбовані 2 мкг/мл Alexa Fluor 350 від IgG козячого антимиша, синього кольору) та антиапоптотичний маркер Bcl-2 (1: 100 кролячого антитіла) - Bcl2, пофарбовані 2 пг/мл Alexa Fluor 488-осел-анти-кролячий IgG; зелений) накладаються для формування злитих зображень. Білі стрілки вказують на клубову стрижку. Чорні стрілки вказують на темний дендрит, який шукає апоптотичні клітини та каналики та протоки в навколишній печінці. I: кишечник. L: печінка. Шкала шкали:. 500 мкм Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 3. 3D-зображення, реконструйовані з конфокальної злитої серії z. 3D-зображення реконструювали з z-конфокальної серії трьох печінок між метаморфічними стадіями 2 і 3. Оптичні зрізи злитих зображень клітин-маркерів печінки цитокератину 19 (миша 1: 100 - анти-CK19; фарбували 2 мкг/мл Alexa Fluor 350 козячий анти-мишачий IgG, синій) та антиапоптотичний маркер Bcl-2 (1: 100 кролячий анти-Bcl2, забарвлений 2 пг/мл Alexa Fluor 488-ослиний кролик проти IgG; зелений) реконструюються за допомогою програмного забезпечення виробника для створювати 3D-зображення. Верхні панелі витягуються з передньої частини, а нижні з заднього кінця. Білі стрілки позначають жовчне дерево. Чорні стрілки вказують на темний дендрит, який шукає апоптотичні клітини та каналики та протоки в навколишній печінці. I: кишечник. L: печінка. Шкала шкали:. 500 мкм Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
. Малюнок 4 конфокального зорового відділу, що показує жовчні протоки з краплями жовчі в просвіті зображення, об’єднане з 3 флуоресцентних каналів; синій: анти-c-Myc миша (1: 100)/2 пг/мл Alexa Fluor 350 козячий анти-мишачий IgG; зелений: 2 пг/мл Нісл зелений; Червоний: Кролик проти TGFβRII (1: 100)/2 пг/мл Alexa Fluor 594-ослик проти кролика. Шкала шкали: 500 мкм. Краплі жовчі позначені чорними стрілками. Зразок печінки брали між метаморфічними стадіями 2 і 3. Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути більшу версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Ще однією перевагою цього нового методу є те, що зразок можна використовувати повторно кілька разів для фарбування різними антитілами 12. Це робить порівняння між різними молекулярними маркерами в одному зразку більш надійним і відтворюваним. Стійкий каркас, що генерується гідрогелем, дозволяє ефективно видаляти антитіла без нескінченної руйнуючої структури і підтримує антигенність нг 12. Лотем. Компенсаційний розчин денатурує антитіла і порушує зв'язування, діючи таким чином розчином антитіл 12. У морі було проведено кілька циклів фарбування зразки печінки міноги, а також структура та фарбування залишалися оптимальними.
Існують дві основні модифікації цього протоколу від початкового протоколу "чіткості" 12. (1) Для ініціювання та прискорення полімеризації гідрогелю замість VA044 використовували реагенти, що генерують вільні радикали (персульфат амонію та TEMED). VA044 є світлочутливим і недоступний у США (2) Не використовується спеціальна камера електрофорезу. У методі CLARTE 12 через розмір тканин (мозок миші проти печінки міноги) електрофоретичне очищення тканин потрібно для прискорення вилучення плазматичної мембрани. Щоб уникнути початкових витрат на замовлену камеру електрофорезу, спочатку в нашій лабораторії потрібні апарати для електрофорезу з агарозним гелем. Це виявилося дуже неефективним. Однак інкубація в освітлювальному розчині з температурою (50 ° C) є дуже ефективною для видалення плазматичної мембрани.
Хоча автори "Ясності" застерігали від використання сапоніну в гідрогелі, це покращує прозорість тканини морської міноги в нашій процедурі. Недоліком конфокальної візуалізації є те, що тканина морської міноги має сильну автофлуоресценцію. Вибір флюорофорів слід перевірити шляхом порівняння зображень до і після імунофлюоресцентного фарбування.
Під час метаморфозу морської міноги регресія епітелію жовчного міхура починається між метаморфічними стадіями 2 і 3. На метаморфічній стадії 4 жовчний міхур повністю зникає з печінки морської міноги 14. Дегенерація жовчних проток є більш драматичною між метаморфічними стадіями 3 і 4 15. Ця модифікована метод є потужним інструментом для вивчення клітинних і молекулярних механізмів дегенерації всієї жовчовивідної системи, що може надати розуміння атрезії жовчовивідних шляхів людини.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Автори визнають внесок біологічної станції Хаммонд-Бей, Наукового центру Великих озер, Геологічної служби США. Ми також дякуємо старшому доктору Мелінді з Центру удосконаленої мікроскопії університету штату Мічиган за його технічну підтримку в області лазерної скануючої конфокальної мікроскопії. Це дослідження фінансується за рахунок грантів Комісії з рибного господарства Великих озер YWCD та WML.