Новий вакцинаційний потенціал rv3131, кодованої доср-регулоном передбачуваної нітроредуктази, проти
предметів
реферат
вступ
У цьому дослідженні ми вивчили імуногенність та захисні ефекти Rv3131, сформульованого в GLA-SE (стійкій емульсії до глюкопіранозилового ліпідного ад'юванту), чітко визначеному ад'юванті TLR4, як вакцинна платформа для субодиниць проти гіпервірулентного впливу Mtb K.
Результати
Транскрипт rv3131 регулюється в фазі експоненціального росту, в гіпоксичному стані та в макрофагах, незалежно від фази росту у вірулентному ізоляті Mtb
38 кДа Rv3131 були підтверджені електрофорезом додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю (SDS-PAGE) та вестерн-блот (1c).
( a ) Рівень експресії rv3131 оцінювали за допомогою qRT-ПЛР. Різні зміни складчастості між Mtb H37Rv (світло-сірий бар) та Mtb K (темно-сірий бар) за різних умов росту, експоненціальної фази та умов гіпоксичної культури визначали за допомогою методу ΔΔCt, а експресію 16 S рРНК використовували як ендогенний контроль. Rv3133c (dosR) використовували як позитивний контроль. ( ) QRT-PCR також використовували для експресії rv3131 Mtb в BMDM. Різні зміни складчастості між Mtb H37Rv (світло-сіра смуга) та Mtb K (темно-сіра смуга) визначали, використовуючи метод ΔΔCt, а експресію 16 S рРНК використовували як ендогенний контроль. Rv3133c (dosR) використовували як позитивний контроль. ( c ) Кумасі-синій забарвлений 10% SDS-PAGE з рекомбінантним білком Rv3131 (ліва панель), очищений в умовах без ендотоксинів і підтверджений Вестерн-блот антитілами до антигістидину (права панель). М: стандартний маркер молекулярної маси.
Імуногенність та імунологічна пам’ять, індуковані імунізацією Rv3131
Кожну групу мишей імунізували та евтаназували, як описано в розділі Методи. Через чотири тижні після останньої імунізації мишей у кожній групі забивали, а їхні клітини легенів та селезінки обробляли Rv3131 (5 мкг/мл) при 37 ° C протягом 12 годин у присутності стопа Гольджі. ( a ) Стратегія регулювання, що використовується для ідентифікації Ag-специфічних багатофункціональних популяцій Т-клітин. ( ) При стимуляції вакциною Rv3131 Ag відсоток Ag-специфічних, багатофункціональних CD4 + CD62L та CD8 + CD62L Т-клітин, які продукують TNF- & agr;, IFN- & ggr; та/або продукування IL-2 у клітинах легенів та селезінки з кожної імунізованої групи оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Середні частоти клітин, що продукують ефекторні цитокіни, представлені у вигляді кругових діаграм. Результати виражаються як середнє значення ± SD для 5 мишей від кожної групи. Значимість відмінностей визначали за допомогою непарного t-критерію. Значення р
Крім того, великі генетичні варіації можуть призвести до змін ефективності вакцини та шляхів експресії генів, які важливі для розвитку вакцини проти туберкульозу. Наприклад, Коен та співавт. прогнозує, що неповне розуміння різноманітності штамів мікобактерій може мати значний негативний вплив на ефективність вакцини, оскільки вакцина замінює нецільові варіанти Mtb штамом 38. Крім того, Homolka et al. припустив, що генетичне різноманіття штамів Mtb підсилює необхідність вирішення проблеми використання різних штамів Mtb як загального кроку у тестуванні вакцин та тестуванні наркотиків 39 .
Тому ми висунули гіпотезу про те, що клінічно переважаючі надмірно виражені генотипи Mtb та штам Ag можуть бути хорошими цільовими групами вакцин. Нарешті, шляхом аналізу мікрочипів транскриптів генів ми виявили, що Rv3131 відповідає вищезазначеному стандарту серед генів, кодованих регулятором DosR. Наскільки нам відомо, це перший випадок, пов’язаний з регулятором DosR, Rv3131 ефективний проти виклику надзвичайно вірулентним клінічним штамом Mtb з Пекіна.
У цьому дослідженні ми досліджували, чи продукував Rv3131 Ag-специфічний IFN-γ під час зараження Mtb K. -Реакція (2а) та тип Т-клітинної відповіді, викликаний вакцинацією Rv3131 та GLA-SE (2, 3 та 4) 5) до та після зараження. Наше дослідження показало, що Rv3131 індукував Ag-специфічну відповідь IFN-γ під час зараження Mtb K і що вакцинація Rv3131 та GLA-SE індукувала сильну реакцію T-клітин, специфічну для Ag. Крім того, вакцина проти субодиниці Rv3131 викликала стійку і стійку реакцію пам’яті на основі Th1 (рис. 2, 3 і 5) та порівнянний захисний ефект проти Mtb K на відміну від індукованого BCG захисту як вакцинацію проти однієї субодиниці Ag 4 Тижні після щеплення. Інфекція (рис. 4).
Нещодавно Zvi та співавт. повідомили, що 189 генів з 3989 продуктів ORF геному Mtb були відібрані в Silico як передбачувані кандидати на вакцину на основі набору даних у масштабі геному, створеного за допомогою обширного аналізу даних та біоінформатики 44. Серед 189 кандидатів на вакцину, Rv3131 та Rv3127, ще одна нітроредуктаза, кодована регулятором DosR, та другий ген за найвищим показником у нашому дослідженні профілю транскрипції були включені до списку 45 найпопулярніших результатів. На додаток до теоретичного аналізу, експериментальні дані свідчать про те, що Rv3131 є Т-клітинним Ag. Наприклад, індуковані Rv3131, Mtb-специфічні Т-клітинні імунні відповіді були зареєстровані у пацієнтів з позитивними тестами на туберкулінову шкіру, але не у здорових людей контролю та хворих на ТБ 45. В якості іншого прикладу, Rv3131 продемонстрував найбільший імуногенний потенціал Ag у порівнянні з іншими Ag, пов'язаними з DosR, протестованими на їх здатність індукувати IFN-γ у латентно інфікованій популяції Гамбії 46 .
Таким чином, наші сучасні дані вказують на те, що кодований DosR Rv3131, новий цільовий Ag для розробки вакцини проти туберкульозу, має потенціал ефективної вакцини Ag, відповідаючи таким критеріям: конститутивна та стабільна експресія в гіпервірулентному пекінському Mtb; здатність розпізнаватися імунною системою під час зараження in vivo; здатність індукувати Ag-специфічні, Th1-упереджені багатофункціональні Т-клітини; та ефективність проти гіпервірулентних штамів Mtb. Отже, Rv3131 може бути чудовим кандидатом для використання у вакцині з множинними антигенами субодиниць Mtb, особливо враховуючи обмежену ефективність вакцини BCG проти пекінської сім'ї.
Методи
Тварини
Всі експерименти на тваринах проводились відповідно до керівних принципів та норм Корейської адміністрації з питань харчових продуктів та медикаментів (KFDA). Експериментальні протоколи були розглянуті та схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (Номер дозволу: 2015-0041) системи охорони здоров’я університету Йонсей (Сеул, Корея). Після схвалення випробувань, самки мишей C57BL/6 без патогенних мікроорганізмів (SPF) у віці 6-7 тижнів були придбані у Japan SLC, Inc. (Шидзуока, Японія) і розміщені в бар'єрних умовах в установі BSL-3 в Avison Biomedical Research Центр при медичному коледжі Йонсей.
Штами бактерій та вироблення бактеріальної РНК
Експерименти та аналізи на мікрочипах
Слайди Mtb oligoarray люб’язно надав Dr. Стефан Г.Є. Кауфманн (Інститут біології інфекцій імені Макса Планка, Берлін, Німеччина). Мічення РНК та гібридизація масивів проводили, як описано раніше 59. Гібридизовані слайди сканували за допомогою сканера мікрочипів GenePix 4000B (Axon Instruments, Каліфорнія, США), а інтенсивність плям визначали та кількісно визначали за допомогою TM4 Microarray Software Suite (//www.tm4.org). Інтенсивність точкових сигналів нормували в MIDAS за допомогою опцій алгоритму LOWESS та загальної напруженості поля. Для статистичного аналізу були використані чотири біологічні репліки для умов експоненціального росту та три біологічні репліки для умов гіпоксичної культури.
Генерація BMDM та інфекція in vitro
BMDM генерувались, як описано раніше 61. Через 6 днів диференційовані BMDM інфікували Mtb H37Rv і K при MOI 10 протягом 24 годин.
Підтвердження експресії rv3131 методом qRT-PCR
Загальний Mtb H37Rv та K-РНК екстрагували з фази експоненціального росту в умовах гіпоксії та інфікованих Mtb BMDM з використанням тризолу, як описано вище. Потім кДНК синтезували, використовуючи основну суміш RT & GO (MP Biomedicals, Німеччина) відповідно до рекомендацій постачальника. Після синтезу диференціальну експресію гена між Mtb H37Rv та K вимірювали за допомогою qRT-PCR, як описано раніше 62. Коротко, qRT-ПЛР проводили на системі ПЛР у режимі реального часу StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, Каліфорнія, США), використовуючи SYBR® Premix Ex Taq ™ II (Takara Bio Inc., Shiga, Японія). qRT-ПЛР проводили, використовуючи наступні набори праймерів; rv3131 вперед, 5'-GTGCCCTAGACCGAATGAAA-3 'і назад, 5'-TAGCGCCCACTCCAAATG-3', dosR (rv3133c) вперед, 5'-AGACATCAAGGGAATGGAGTTG-3 'і назад, 5'-TGGTCGTAAGAGACGACGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCAGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC 3 'і назад, 5'-CGGGACTTAACCCAACATCTC-3'. Зміни кратності експресії генів між Mtb H37Rv та Mtb K обчислювали за допомогою методу ΔΔCt, а 16 S рРНК використовували для нормалізації. Для статистичного аналізу використовували три біологічні повтори.
Експресія та очищення рекомбінантного білка Rv3131
Імунізація мишей
Мишей C57BL/6 імунізували трьома внутрішньом’язовими ін’єкціями з інтервалом у три тижні. Кожна імунізація містила 5 мкг рекомбінантного білка Rv3131 з 5 мкг GLA-SE (глюкопіранозил-ліпід-ад'ювант), сформульованого в стабільній емульсії масло-у-воді (SE) від IDRI (Інститут інфекційних хвороб). GLA-SE люб'язно надав IDRI (Сіетл, Вашингтон, США). Для імунізації BCG мишам вводили підшкірно 2 × 10 5 CFU BCG Pasteur 1173P2. Контрольну групу мишей імунізували лише GLA-SE. Клітини селезінки та легенів збирали та використовували для аналізу імуногенності через 4 тижні після останньої імунізації.
MTB-інфекція
Через чотири тижні після останньої імунізації ад'ювантний контроль (GLA-SE) та вакциновані миші (BCG, Rv3131/GLA-SE) були аерогенно інфіковані штамом Mtb K, як описано вище 63. Коротко кажучи, мишей піддавали впливу Mtb K протягом 60 хвилин в інгаляційній камері пристрою для зараження повітря (Glas-Col, Terre Haute, IN), відкаліброваному для доставки заздалегідь визначеної дози. Для підтвердження початкового бактеріального навантаження чотири миші були евтаназовані через добу, і приблизно 150 життєздатних бактерій були випущені в легені кожної миші.
Вимірювання цитокінів
Поодинокі клітини, приготовані з селезінки та легенів інфікованих Mtb або імунізованих мишей, стимулювали Rv3131 (5 мкг/мл) або PPD (2 мкг/мл) протягом 24 годин при 37 ° С. PPD люб’язно надав доктор Бреннан в Aeras (Роквілл, штат Медіка, США). Рівні секретованого IFN-γ (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія), IL-4 та IL-5 (BD Bioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія) у супернатанті культури визначали за допомогою комерційного набору ELISA згідно з інструкціями виробника.
Титр антитіл у сироватці крові
Rv3131-специфічні реакції IgG1 та IgG2c у сироватці крові оцінювали, як описано раніше 63. Коротко, 96-лункові планшети заповнили 2. г/мл Rv3131 з покриттям; В якості вторинного антитіла використовували кон'юговане антитіло до пероксидази хрону (HRP) проти IgG1 (BD Bioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія) або IgG2c (Southern Biotech, Бірмінгем, Алабама). Оптичні щільності (OD) визначали при 495 нм протягом 15 хвилин після закінчення реакції.
Аналіз субпопуляцій Т-клітин
Одноклітинні суспензії клітин легенів і селезінки готували, як описано раніше 65. Суспензії одноклітинних спочатку блокували анти-CD16/32 протягом 15 хвилин при 4 ° C. Після покриття клітинної поверхні набором LIVE/DEAD ™, що фіксується, Aqua-Dead-Cell-Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), Brilliant Violet 421 (BV421) -кон’югований анти-CD3 & epsi; -Перідинін-хлорофіл (PerCP) -Cy5,5-кон'югований анти-CD4, аллофікоціанін (APC) -Cy7-кон'югований анти-CD8 (BD Bioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія), кон'югований анти-CD44, фікоеритрин (PE), Кон'юговане анти-CD127 та флуоресцеїновий ізотіоціанат (FITC) антитіло до CD62L (eBioscience, Сан-Дієго, Каліфорнія) протягом 30 хвилин при 4 ° C, підраховуючи кожен тип Т-клітин пам'яті за допомогою FACSVerse- Проаналізовано проточні цитометри (BD Biosciences) та комерційне програмне забезпечення (FlowJo).
Внутрішньоклітинне забарвлення цитокінів
Суспензії одноклітинних імунізованих та інфікованих мишей (2 × 10 6 клітин) стимулювали Rv3131 (5 мкг/мл) або PPD (2 мкг/мл) при 37 ° С протягом 12 годин у присутності GolgiStop (BD Bioscience). Клітини спочатку промивали PBS, блокували анти-CD16/32, що блокує антитіло, при 4 ° C протягом 15 хвилин, а потім фарбували поверхнево міченими флуорохромом антитілами проти CD3, CD4, CD8 і CD62L, а також LIVE/DEAD TM Fixable Aqua Dead Набір клітин протягом 30 хвилин при 4 ° C. Як негативний контроль клітини фарбували поверхнею відповідним ізотипом відповідним імуноглобуліном (Ig). Клітини промивали Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) протягом 30 хвилин при 4 ° C, фіксували та проникали. Клітини двічі промивали Perm/Wash (BD Biosciences), а потім внутрішньоклітинно фарбували кон'югованим APC анти-TNF-α, кон'югованим PE-анти-IFN-γ та кон'югованим PE-Cy7 анти-IL-2 (BD Biosciences) 30 хв при 4 ° C. Клітини промивали Perm/Wash і потім фіксували IC-буфером для фіксації (eBioscience). Після ресуспендування в PBS клітини аналізували за допомогою проточного цитометра.
Перелік бактерій та гістопатологічний аналіз
Статистичний аналіз
Усі результати in vitro є репрезентативними як мінімум для трьох незалежних експериментів із постійними результатами. Дані на графіках представлені як середнє значення ± стандартне відхилення (SD). Дані експерименту in vivo подаються як медіана міжквартильного діапазону (IQR). Порівняння між зразками проводили за допомогою непарного t-тесту або одностороннього ANOVA з подальшим тестом багаторазового порівняння Тукі, коли дані зазвичай розподілялись за допомогою Prism 5 (GraphPad Software версія 5, Сан-Дієго, Каліфорнія).
Додаткова інформація
Як цитувати цю статтю: Kwon, KW et al. Новий вакцинний потенціал Rv3131 - передбачуваної нітроредуктази, кодованої регулятором DosR, проти гіпервірулентного штаму Mycobacterium tuberculosis K. Sci. Респ. 7-й, 44151; doi: 10.1038/srep44151 (2017).
Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо претензій щодо юрисдикції в опублікованих картах та інституційних зв'язках.
Додаткова інформація
Документи Word
Додаткова інформація
Зауваження
Надсилаючи коментар, ви погоджуєтесь з нашими умовами використання та правилами спільноти. Якщо ви виявите щось образливе або не відповідає нашим умовам чи інструкціям, позначте це як неприйнятне.