Обговорення Стажування Марі Хелен Гійо Глютамат дегідрогеназа очищення EC 1

Очищення глутаматдегідрогенази ЕС 1.4.1.4 із насіння Pisum sativum - Марі-Елен Гійо - 2004

гійо

Обговорення - Висновок - Перспективи

1-а частина: очищення

в. Сирий екстракт та осади сульфату амонію

Перший етап очищення дозволяє отримати лише коефіцієнт очищення, близький до 1. Після осадження сульфатом амонію 64% загальної кількості білків відновлюється, отже, цей етап сприяв елімінації білків.

Однак відновлюється лише 59% загальної аміноактивності GDH. Цю втрату ферментативної активності можна пояснити інактивацією GDH після обробки сульфатом амонію. Висока іонна сила, індукована сіллю, може спричинити денатурацію ферменту.

Дезамінуюча активність GDH становить 14181 нмоль/хв -1 у неочищеному екстракті та 8448 нмоль/хв -1 у зразку після осадження (NH4) 2SO4. Отже, існує така ж кількість амінуючої діяльності, як і дезамінуючої. Кілька гіпотез можуть пояснити ці результати:

b. DEAE-целюлозна аніонообмінна хроматографія

Не маючи даних щодо досліджуваного ферменту, ми не знали, зв'язуватиметься фермент з діетиламіноетильними групами (DEAE) гелю чи ні. 49% загальної амінуючої активності GDH виявляється після елюції NaCl. Отже, 83% амінуючої активності виявляється порівняно з попереднім кроком.

Білок прикріпився, що означає, що при рН 7,5 NADPH-GDH має негативний загальний електричний заряд.

Цей досвід дає нам додаткову інформацію. PKa DEAE дорівнює 9,5, тобто при pH 9,5 DEAE має загальний нульовий електричний заряд. При рН 7,5 (тобто pKa-2) загальний електричний заряд DEAE є позитивним.

Для зчеплення фермент повинен мати негативний загальний електричний заряд при рН 7,5. Таким чином, ми робимо висновок, що ізоелектрична точка ферменту становить близько 5,5, тобто при рН 5,5 фермент несе стільки позитивних зарядів, скільки негативних зарядів.

Ці дані важливі, оскільки вони характеризують фермент. Однак значення потрібно вказувати на чистому NADPH-GDH.

Ця стадія очищення дозволяє отримати загальну амінуючу активність GDH 49% і відновити 43% загальної кількості білків. Коефіцієнт очищення збільшується і досягає 1,76, як і питома активність GDH (6,7 нмоль. Хв -1. Мг -1).

Крім того, на профілі елюції спостерігаються два піки. Ці два піки подібні як за загальною активністю, питомою активністю, коефіцієнтом очищення, кількістю загального білка та виходом. Ці два піки можна пояснити існуванням декількох ізоформ GDH.

Що стосується дезамінувальної активності, її можна знайти лише в POOL 1 зі швидкістю 704 нмоль/хв -1 .

Результати POOL 1 можуть бути інтерпретовані по-різному:

  • Це може бути дезамінуюча активність ізоформи [ЄС 1.4.1.2]. У цьому випадку цей етап очищення дав би можливість частково відокремити ізоформу [ЄС 1.4.1.4] від ізоформи [ЄС 1.4.1.2], оскільки 44% амінуючої активності виявляється в БАС 1 проти 8% дезамінування, порівняно зі стадією осадження сульфату амонію.
  • Це може бути дезамінуюча активність, яку ізоформа [ЄС 1.4.1.4] здатна мати не переважно, що становить 19% амінуючої активності. У цьому випадку в цьому пулі міститься лише GDH [EC 1.4.1.4].

У POOL 2 не було виявлено жодної дезамінувальної активності. Знову це можна пояснити:

  • Це може бути ізоформа [EC 1.4.1.4], яка елюювалась пізніше, ніж перший пул. Це явище може бути наслідком обробки сульфатом амонію, який міг змінити третинну структуру і, отже, передбачає різницю в поведінці.
  • Це може бути ізоформа [ЄС 1.4.1.3], яка реагує таким чином у вибраних умовах (рН.).

Для кожного з двох пулів це також може бути суміш ізоформ.

проти Хроматографія за афінною пігментом

Пігментний гель складається із зеленої смоли, на якій ковалентно зв’язані ліганди, які мають структуру, подібну структурі NAD (P). Ферменти, що залежать від кофакторів NAD (P), зможуть зв’язуватися з ним. Дійсно, більша частина загальної активності амінанту GDH відновлюється після елюції NaCl (33% порівняно з попередньою стадією очищення).

В результаті цього етапу виводиться багато загального білка (лише 2,4% від загального білка залишається порівняно з попереднім етапом), що дозволяє досягти коефіцієнта очищення 23,89. Питома активність також збільшується і досягає 90,8 нмоль. Хв -1. Мг -1, що є доказом ефективності очищення.

Крім того, кожен пул, отриманий в результаті DEAE-целюлозної хроматографії, дає два пули після елюції NaCl на пігментному гелі. Оскільки в басейні А міститься дуже мало загальної активності НАДФН-ГДГ, а в басейні С втрачено, наступна робота проводиться на басейні В і басейні D.

БАСЕЙН B - це басейн, що містить найбільшу загальну амінуючу активність GDH, і в ньому виявляється дезамінуюча активність. Останній становить 20% амінуючої активності. У POOL D. немає дезамінізуючої активності. Ці результати узгоджуються з результатами, виявленими після DEAE-целюлозної хроматографії. Отже, висновки ідентичні висновкам, зробленим на попередньому кроці.

d. Афінна хроматографія NAD/ATP

Ця хроматографія дозволяє відокремити NAD-залежні білки, які будуть прилипати до гелю, від NADP-залежних білків, які будуть елюйовані. Таким чином, якщо існує NAD-залежний GDH, тобто ізоформа [ЄС 1.4.1.2], тоді сподіваємось, що вона буде повністю відокремлена від ізоформи [ЄС 1.4.1.4].

У пулі B загальна амінуюча активність становить 1733 нмоль/хв -1, тобто вихід 94% відносно пулу B з попередньої хроматографії. Кількість загального білка становить 14,83 мг, трохи більше, ніж на попередньому кроці. Це значення, ймовірно, завищене. Ця хроматографія показує, що не було очищення порівняно з пігментною хроматографією.

Діамінуюча активність становить 340 нмоль/хв -1, тобто 90% від дезамінуючої активності попереднього етапу. Деамінуюча активність знову представляє 20% амінуючої активності. Однак при цьому типі хроматографії специфічні ферменти NAD залишаються прикріпленими до гелю.

Таким чином, ці результати підтвердять гіпотезу про те, що виміряна дезамінуюча активність дійсно є активністю GDH [ЄС 1.4.1.4], яку вона каталізує в непільговому режимі, і, отже, ГДГ [ЄС 1.4.1.4] буде добре відокремлена GDH [ЄС 1.4.1.2].

Що стосується POOL D, то загальна амінуюча активність зменшується, і вихід становить лише 1% (тобто 32% відновлено порівняно з попереднім кроком). Кількість загальних білків також зменшується, але коефіцієнт очищення збільшується і досягає 20,12, а також питома активність, яка дорівнює 76,47 нмоль. Хв -1. Мг -1. Для цього басейну було очищення.

Частина 2: Молекулярна маса природного ферменту та його субодиниць

в. Superdex G200 стерильна ексклюзивна хроматографія

У басейні B ми знаходимо білок з МВ приблизно 360 кДа, що може відповідати МВ МВ GDH [EC 1.4.1.4]. Дійсно, в літературі пропонується, що ГДГ [ЄС 1.4.1.4] є гексамерами 300 кДа. Значення також може бути трохи завищене, це через поводження. Інші елюйовані білки мають нижчий МВт і, схоже, не відповідають GDH.

У басейні D є білки 158 кДа. Можливо, вони відповідають GDH [EC 1.4.1.4], розділеному навпіл через застосовані методи лікування.

Вимірювання загальної активності амінантів і дезамінантів, які не проводились, важко зробити точний висновок про природу білків, що складають різні піки.

b. Електрофорез SDS-PAGE

Крім того, якщо взяти до уваги результати електрофорезу SDS-PAGE, існують білки, субодиниці яких мають МВ 45 КДа в POOL B і 48 kDa в POOL D в кінці пігментної хроматографії. Однак література припускає, що GDH [EC 1.4.1.4] має субодиниці 50 кДа. Депутати підгрупи басейнів B та D наближаться до цього значення.

Висновки залишаються складними з огляду на те, що на останніх зразках електрофорез не проводився.

3. Висновки та перспективи

Що стосується всіх результатів, можна висловити кілька гіпотез. Наприкінці перших трьох DEAE-целюлози, пігментів, хроматографій NAD/ATP сильна амінуюча активність GDH присутня в POOL 1 і в POOL B (який сам походить з POOL 1).

Діамінуюча активність також вимірюється на кожному з етапів хроматографії, і вона становить 20% амінуючої активності в кожному випадку. Це наводить нас на думку, що саме активність ізоформи [ЄС 1.4.1.4] переважно каталізує реакцію амінування.

Крім того, результати гель-фільтраційної хроматографії показують наявність білка 360 кДа. Це значення молярної маси близьке до значень GDH [ЄС 1.4.1.4] з літератури.

Відповідно до електрофоретичного профілю POOL B на пігментах знайдено білкові субодиниці 45 кДа, які відповідають майже літературним значенням субодиниць (50 кДа) GDH [EC 1.4.1.4]. Тому ми можемо припустити, що частково виділили GDH [ЄС 1.4.1.4] Pisum sativum наприкінці маніпуляцій.

Що стосується басейну D із басейну 2 DEAE-целюлози, висновки є більш складними. На кожному етапі хроматографії вимірюється лише амінуюча активність.

  • Можливо, це ще одна з ізоформ GDH, яка підтверджує існування кількох пулів.
  • Можливо, саме GDH [EC 1.4.1.4] денатурований або змінений внаслідок застосовуваних методів лікування. Зміна може втратити третинну та четвертинну структуру, що пояснювало б відмінності в іонній поведінці, спорідненості або навіть молекулярній масі порівняно з природним білком.
  • Дійсно, це може бути GDH [EC 1.4.1.4], розщеплений навпіл, оскільки в цьому пулі ми знаходимо білки 158 кДа та субодиниці 48 кДа.

Щоб завершити, необхідно заповнити протокол очищення.

В кінці хроматографії Superdex G200 виявляються різні пікові білки. Тепер необхідно виміряти активність амінування та дезамінування на кожному з піків БАСЕЙНІВ B і D. Тоді на цих зразках повинен бути проведений електрофорез SDS-PAGE.

Таким чином, білки пулів, що виявляють сильну амінуючу активність, можуть бути секвенувані. Порівнюючи з послідовностями GDH [EC 1.4.1.4] інших організмів, ми зможемо дізнатися, чи справді очищений білок є GDH [EC 1.4.1.4] насіння гороху.

Якщо очищеним ферментом є GDH [EC 1.4.1.4], була визначена перша характеристика. Дійсно, pI цього ферменту, як видається, становить приблизно 5,5 за результатами DEAE-целюлозної аніонообмінної хроматографії. Це можна вказати на чистому GDH.

З ферментативної точки зору тоді можна буде визначити кінетичні властивості ферменту (Km, Vmax, інгібітори.), А також його первинну, вторинну, третинну та четвертинну структуру.

Нарешті, буде цікаво виділити ген або гени, що регулюють цей ізофермент, і також можна буде синтезувати антитіла до гороху [EC 1.4.1.4], щоб проводити швидкі аналізи ферменту в різних партіях.