Оптимізований аналіз протоколу печінкового стеатозу in vivo та in vitro (перекладено німецькою мовою)
Вступ
Ожиріння є зростаючою проблемою здоров'я як у розвинутих, так і в країнах, що розвиваються. Як повідомляється, одне із супутніх захворювань 1 часто асоціюється з неалкогольною жировою печінкою (НАСГ), поширеність якої становить від 30 до 100 відсотків у пацієнтів з НАСГ. Через сильну кореляцію між жировою печінкою та ожирінням, модельовані ожирінням (DIO) моделі миші широко використовуються для вивчення складних молекулярних механізмів, що беруть участь у розвитку НАЖХП 2, 3, 4, 5, 6. Печінковий стеатоз - це найраніша стадія НАЖХП, він може прогресувати до неалкогольного стеатогепатиту (NASH), цирозу та, зрештою, раку печінки 7. Отже, загальною метою цього методу є створення тваринних та клітинних моделей стеатотичних станів печінки та надання детальних протоколів для ефективного використання і точне вимірювання ліпідів. Ці моделі та вимірювання також підходять для вивчення інших метаболічних порушень, таких як резистентність до інсуліну та діабет 2 типу.
Оскільки ожиріння визначено одним із основних факторів ризику розвитку НАЖХП, дієта з високим вмістом жиру та сахарози з високим вмістом сахарози (HFHS), що імітує західну дієту з високим вмістом жиру, використовується для стимулювання ожиріння у мишей. Потім ступінь стеатозу печінки можна оцінити за допомогою різних методів. По-перше, аналіз маси тіла та складу тіла за допомогою ядерно-магнітного резонансу (ЯМР) показує накопичення ліпідів під час годування. Жирову масу та м’язову масу можна кількісно визначити неінвазивно та в режимі реального часу.
Крім того, магнітно-резонансна томографія (МРТ) використовується для відображення розподілу жиру як у всьому тілі, так і в печінці. Сигнал відтінків сірого, отриманий за допомогою МРТ-аналізу, може бути перетворений у читабельне псевдокольорове зображення, а інтенсивність відтінків сірого та кольору є напів кількісною. Ця технологія пропонує унікальні переваги для вимірювання накопичення ліпідів у живих тварин. По-друге, гістологічний аналіз печінки є найпоширенішим методом визначення стеатозу печінки. Фарбування гематоксиліном та еозином (H&E) надає гістологічні дані, такі як морфологія гепатоцитів та інфільтрація макрофагів, тоді як фарбування Oil Red-O показує розмір та положення крапель ліпідів у гепатоцитах. По-третє, аналіз вмісту ліпідів за допомогою екстракції хлороформу/метанолу є точним та кількісним вимірюванням ліпідів печінки. Загальний рівень тригліцеридів та холестерину можна виміряти за допомогою біохімічних методів. Важливо, щоб аналіз екстракції ліпідів та фарбування Олійного червоного O також використовувались у генетично маніпульованих або фармацевтично оброблених гепатоцитах.
Перевагою даного методу є використання декількох оптимізованих підходів для створення стеатотичних моделей печінки та всебічної характеристики фенотипів як in vivo, так і in vitro. Моделі DIO-мишей можуть рекапітулювати патологію та метаболічний фенотип жирової хвороби печінки людини. Інші параметри метаболізму у людини можуть бути відтворені і в цій моделі 8. Створення стеатотичної моделі гепатоцитів у відповідь на високий рівень глюкози та інсуліну є ефективним, корисним та долає обмеження дорогого та трудомісткого функціонування миші. У сукупності ці методи є достатніми та необхідними для дослідження розладів ліпідів печінки та резистентності до інсуліну у разі перевантаження поживних речовин.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Всі протоколи випробувань на тваринах схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин при Інституті харчування людей Шанхайського інституту біологічних наук Китайської академії наук (Шанхай, Китай).
2. Первинна модель гепатоцитів миші
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Як і в 1А Як було показано, вага тіла миші була збільшена до 45 ± 1,2 г після 16 тижнів годування HFHS, що приблизно в 1,5 рази вище, ніж у групі, яка харчувалася дієтою. Наведено аналізи складу ЯМР тіла, що показують жирову масу та м’язову масу мишей (1В). Розподіл жиру у всьому тілі та печінці визначали за допомогою МРТ, а репрезентативні псевдокольорові зображення у мишей, що живуть у свідомості 1C-D показано. Вагу тіла та склад тіла вимірювали та візуалізували під час дієтичного годування HFHS.
Для розтину стеатотичних фенотипів мишей забивали і проводили гістологічний аналіз печінки. Пляшки печінки H&E і Oil Red O знаходяться 2A-B продемонстровано в краплях ліпідів більших розмірів, які займають місця у більшості гепатоцитів через 4 місяці дієтичного харчування HFHS. Ступінь печінкового стеатозу мишей, що харчуються HFHS, можна легко візуалізувати, порівнюючи мишей, яких годували дієтою Чоу. Основні компоненти ліпідів, такі як тригліцериди та холестерин, екстрагували за допомогою хлороформу/метанолу (2С) виміряний. У мишей DIO надмірне перевантаження поживними речовинами викликає ненормальне накопичення тригліцеридів у печінці. На основі даних ЯМР, МРТ та гістологічного аналізу ступінь відкладення ліпідів буде визначено ефективно та точно.
Як і в 3 показано, рівень ліпідів у первинних гепатоцитах індукувався високим вмістом глюкози та інсуліну протягом 24 годин. Краплини ліпідів, що накопичились, були позначені масляним червоним фарбуванням O (3А) а кількісний аналіз ліпідів супроводжувався рівнем тригліцеридів і холестерину в гепатоцитах (3B) використовується для вимірювання визначеного. На основі моделі ефективні та швидкі результати дослідження генетичної модифікації або фармацевтичного лікування на ліпідний гомеостаз у гепатоцитах.
Обговорення
NASH - це серія прогресуючих захворювань печінки, пов’язаних із метаболічним синдромом, ожирінням, резистентністю до інсуліну або цукровим діабетом 2 типу (T2DM) 11. Відмінною рисою НАЖХП є стеатоз, накопичення ліпідів у гепатоцитах. Тут представлений спектр методів для характеристики фенотипів та параметрів стеатозу печінки з використанням первинних гепатоцитів мишей та мишей DIO. Ця процедура може допомогти з'ясувати молекулярні механізми НАЖХП та інших пов'язаних з цим метаболічних розладів.
Аналізи складу тіла, включаючи ЯМР та МРТ, забезпечують неінвазивні дані в реальному часі про ліпіди у всьому тілі та печінці. Це неінвазивне, економію часу, візуалізація та напівякісне вимірювання. Крім того, точність аналізу складу тіла можна значно покращити, поєднуючи інші гістологічні та біохімічні вимірювання. Критично важливо і важливо визначати стеатоз печінки in vivo та in vitro за допомогою фарбування H&E, масляного червоного плями O і вимірювання ліпідів, які є золотими стандартними вимірами для діагностики та оцінки стеатозу печінки.
Одним з обмежень цього способу є його нездатність вимірювати запалення та відкладення колагену, оскільки простий стеатоз переростає у гепатит, фіброз, і, зрештою, цироз та рак печінки. Оскільки миші з ожирінням, викликані дієтою, мають низький ризик розвитку NASH, поточного протоколу достатньо для оцінки стеатозу печінки у мишей DIO. Однак за умови NASH слід застосовувати інші біохімічні вимірювання, такі як рівні аланінамінотрансферази (ALT) та аспартатамінотрансферази (AST) у плазмі крові.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори заявляють, що не мають фінансових інтересів.
Фінансування: Ця робота була підтримана грантами Національного фонду природничих наук Китаю (№ 81270930, 31471129 та 31671224) та Програмою Сто талантів Китайської академії наук (2013OHTP04) для YL