Ортотопічна модель раку ендометрія з ретроперитонеальною лімфаденопатією, виготовлена з In Vivo
Резюме
Цей протокол забезпечує стандартизований метод вирощування клітин VX2 у культурі та створення ортотопічної моделі VX2 раку ендометрія з метастазами в заочеревинних лімфатичних вузлах у кроликів. Моделі ортотопічного раку ендометрія важливі для доклінічного дослідження нових методів візуалізації для діагностики метастазів у лімфатичні вузли.
Анотація
Рак ендометрія є найпоширенішим гінекологічним злоякісним захворюванням у Північній Америці, і захворюваність зростає у всьому світі. Лікування складається з хірургічного втручання з допоміжною терапією або без неї, залежно від ураження лімфатичних вузлів, що визначається лімфаденектомією. Лімфаденектомія є хворобливою процедурою, яка не має терапевтичної переваги у багатьох пацієнтів, і тому необхідний новий метод діагностики метастазування в лімфатичні вузли. Для тестування нових засобів візуалізації необхідна надійна модель раку ендометрія з метастазами в заочеревинний лімфатичний вузол. Модель карциноми ендометрія VX2 широко описана в літературі; Однак існують суттєві відмінності в способі встановлення моделі. Крім того, жодних досліджень щодо використання культивованих клітин VX2 для створення цієї моделі не надходило, оскільки до цього часу використовувались лише клітини, що розмножуються in vivo. Ми представляємо стандартизований хірургічний метод та метод післяопераційного моніторингу для встановлення моделі раку ендометрія VX2 та повідомляємо про перше використання культивованих клітин VX2 для створення цієї моделі.
Вступ
Кілька груп повідомляли про використання VX2 для моделювання раку ендометрія з ретроперитонеальними метастазами з високим рівнем успішності 36, 51, 52; Однак у сучасній літературі існують суттєві відмінності у способі побудови моделі. Повідомлялося, що дози суспензій клітин досягають 4 х 10 5 клітин/матковий ріг 51 та 5 х 10 9 клітин/матковий ріг 37, 53 без стандартного консенсусу щодо необхідної дози клітин VX2. Також повідомлялося про різноманітні методи вакцинації, включаючи мікрохірургічну імплантацію пухлин у міометрій матки 36, ін’єкцію суспензії клітин VX2 37, 44, 52, 53, а в деяких випадках додавання швів маткових рогів до інокуляції 52. Нарешті, жодна група не повідомляла про використання культивованих клітин VX2 для створення цієї моделі. Отже, мета цього дослідження - продемонструвати успішний стандартизований метод моделювання VX2 та повідомити про перше використання культивованих клітин VX2 для моделювання раку ендометрія з ретроперитонеальними метастазами у кроликів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Оклюзія глибокої черевної стінки: Визначте кінчик розрізу очеревини та захопіть очеревину, прямий м’яз та фасції тканинними щипцями. Усі дослідження на тваринах проводились у затверджених Центром ресурсів тварин (ARC) університетських мережах охорони здоров’я та відповідно до затверджених Протоколів про використання та догляд за тваринами (AUP № 3994/# 4299). Клітинна лінія VX2 була отримана від Dr. Перемогла лабораторія Akens в університетській мережі охорони здоров’я.
1. Побудова клітинної лінії VX2 in vitro
2. Культура клітин VX2 та утворення суспензії клітин
3. Налаштування хірургічної моделі
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
За допомогою нового візуалізатора Porphyso було виявлено 81 лімфатичний вузол інтраопераційно та хірургічно видалено для гістологічного аналізу. 74 лімфатичні вузли - ліві тазові лімфатичні вузли, 5 - праві тазові лімфатичні вузли та 2 - праві парааортальні лімфатичні вузли. Лімфатичні вузли, видалені у кроликів з розмноженими пухлинами VX2 in vivo, були значно більшими та більш некротичними, ніж у кроликів із культивованими пухлинами VX2 із середнім обсягом 0,99 см 3 (діапазон 0,12-3,89 ) порівняно з 0,59 см 3 (0,01 - 2,92) (р = 0,037). Кролики з пухлинами, розмноженими in vivo, також мали більші некротичні пухлини матки, ніж кролики з культивованими клітинними пухлинами із середньою довжиною 5,6 см (4-6,8 см) і середньою шириною 5,2 см (3,3-9 см) проти 3,6 см (2-5 см) або 4,56 см (3-7 см). Нарешті, кролячі моделі з клітин VX2, розмножених in vivo, мали більше позавузлових абдомінальних метастазів, ніж кролячі моделі з культивованих клітин, при цьому 91% всіх метастазів виявляли у кроликів, розмножених in vivo.
| Тип моделі | Модель пухлини VX2 in vivo | Культурна модель пухлини VX2 |
| Кількість вдалих моделей | 16 | 5 |
| Кількість випробуваних моделей | 22 * | 8-й |
| Показник успіху моделі | 73% | 63% |
| Час від щеплення до експерименту | 29 днів (24-31) | 45 днів (36-51) |
| Успішна доза ін’єкції | 1 х 10 7 | 40 х 10 6 |
| (5x10 6 на ріг матки) | (20 х 106 на ріг матки) | |
| Загальний показник успіху | 75% | |
| Загальний показник успішності перед швом матки | 57% | |
| Загальний показник успішності після ушивання матки | 81% | |
Таблиця 1: Дані моделі, включаючи експериментальні умови, кількість використаних тварин та рівень успіху. Два кролики, спочатку використовувані для культивованих клітинних пухлин, які не зросли, згодом використовувались для моделей пухлин in vivo
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
У цьому документі ми повідомили стандартизований хірургічний метод для встановлення моделі раку ендометрія VX2 та повідомили про перше використання культивованих клітин VX2 для створення цієї моделі. Швидкість поглинання пухлини на 75% нижча, ніж на 100%, що повідомлялося раніше в літературі 35, 37, 53, 56; проте частота патологічно підтверджених метастазів у лімфатичні вузли на 90% відповідає попереднім дослідженням цієї моделі 35, 53 .
Загалом, ми повідомили простий, стандартизований метод моделювання раку ендометрія з ретроперитонеальною лімфаденопатією у кроликів. За допомогою цього протоколу ми розглянули значну мінливість в літературі VX2 щодо дози клітин, хірургічної техніки та моніторингу післяопераційної моделі. Ми визнаємо, що іншим обмеженням дослідження є те, що коли ми використовуємо клітинну лінію VX2 замість ксенотрансплантата людини, ми не повністю імітуємо біологію пухлини та мікросередовище раку людини. Однак ми сподіваємось, що інші групи використовуватимуть культивовані клітини VX2 для побудови своїх моделей, оскільки ми вважаємо, що цей тип клітин може надійніше моделювати рак ендометрія людини через його повільніший ріст і зменшену схильність до метастатично-метастатичних захворювань. Ми закликаємо інші групи використовувати цю швидку і просту модель порожнини матки при метастазуванні в заочеревинний лімфатичний вузол для вивчення нових методів візуалізації, щоб допомогти пацієнтам з метастатичним раком ендометрія.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Це дослідження фінансували Науково-дослідний інститут Террі Фокса (PPG-1075), Канадський інститут досліджень охорони здоров’я (Фонд гранту # 154326), Канадський дослідницький інститут онкологічного товариства (704718), Рада з природничих та технічних досліджень Канади, Фонд інновацій Фонд принцеси Маргарет.
Я хочу д-ра Ми вдячні Marguerite Akens за надання перших клітин VX2 для створення оригінальної моделі VX2 та заморожених блоків пухлини VX2. Я хотів би подякувати Марко ДіГраппі за підтримку у проведенні перших експериментів з культурою клітин VX2 та Лілі Дінг за підтримку у культурі клітин VX2.