PDF ДОСЛІДЖЕННЯ ПРО ГЛЮКОЗНИЙ МЕТАБОЛІЗМ - Безкоштовно завантажте PDF
Короткий опис
1 55 ДОСЛІДЖЕННЯ З МЕТАБОЛІЗМУ ГЛЮКОЗИ А. БІОХІМІЧНІ ПРИНЦИПИ У здорових людей рівень глюкози в крові становить.
Опис
ДОСЛІДЖЕННЯ ГЛЮКОЗНОГО МЕТАБОЛІЗМУ A.
Хронічні захворювання печінки виникають або спричинені переважанням протиострівних гормонів (наприклад, при акромегалії, хворобі Кушинга, феохромоцитомі). Первинні форми діабету поділяються на дві основні групи, а саме діабет I типу, так званий юнацький діабет, причиною якого в даний час вважають імунологічні фактори, що призводять до руйнування В-клітин і, отже, до дефіциту інсуліну, з іншого боку II Діабет (діабет дорослих), для якого вирішальними є інші, частково досі невідомі механізми. Як правило, це призводить не до нестачі інсуліну, а, швидше, до зменшення інсулінового ефекту, наприклад через відсутність рецепторів інсуліну. Зокрема, особливо при діабеті ІІ типу, який може повільно прогресувати протягом більш тривалого періоду часу і, таким чином, залишатися не виявленим, прогресування захворювання можна запобігти, якщо лікувати фактори ризику ожиріння, порушення обміну ліпідів, фізичну бездіяльність та переважання антиінсулінових гормонів. Тест на толерантність до глюкози, проведений на стажуванні, відіграє важливу роль у виявленні.
При цукровому діабеті I типу імунологічні скринінгові тести (на виявлення антитіл проти частин острівцевих клітин) відіграватимуть більшу роль у майбутньому, оскільки вони з’являються задовго до початку захворювання, яке, як правило, є раптовим для пацієнта. На цей момент, однак, 80% клітин острівців, як правило, вже зруйновані. Є
Підтримка рівня глюкози в крові постійним шляхом суворого метаболічного контролю (інсулін, дієта, фізичні вправи) з метою затримки вторинних захворювань, таких як атеросклероз, сліпота, пошкодження нирок, гангрена та невропатії. Визначення глікозильованого гемоглобіну, проведене на стажуванні, є важливою підмогою для цього. Пацієнти, які страждають від неконтрольованого діабету, часто мають високі концентрації глюкози в крові в плазмі. Це призводить до підвищення концентрації глікованого гемоглобіну в еритроцитах. Еритроцити здорових людей з нормальним рівнем глюкози в крові містять 4-7% загального гемоглобіну в глікозильованій формі. У погано або погано контрольованих діабетиків це значення може досягати 18-20%. Визначення глікозильованого гемоглобіну дозволяє довгостроково спостерігати рівень глюкози в крові. Після модифікації гемоглобін залишається в крові, поки еритроцит живий (приблизно 120 днів). Підвищений рівень глікованого гемоглобіну починає падати лише через 5-6 тижнів після регулювання рівня глюкози і досягає норми приблизно через 20 тижнів.
Позначає концентрацію глюкози в крові, концентрація глікованого гемоглобіну являє собою своєрідний інтеграл за рівнем глюкози в крові протягом декількох тижнів.
Тест на толерантність до глюкози Під час тесту на толерантність до глюкози рівень глюкози в крові вимірюють через 1,5 години після перорального впливу глюкози, а її курс протягом часу порівнюють із звичайним колективом. На додаток до цього непрямого тесту на функціональність В-клітин острівців Лангерганса, часовий хід концентрації інсуліну в сироватці крові можна також визначити безпосередньо, використовуючи складні імунологічні методи. Збільшення і зменшення концентрації глюкози в крові, що спостерігаються при тесті толерантності до глюкози у здорових людей (нормальний колектив) або у діабетиків, наведено в таблиці I. Підозрюється безсимптомний цукровий діабет, якщо перевищено максимальне значення 11,1 ммоль/л, яке очікується через 30-60 хвилин. 2-годинне значення є діагностично більш цінним; якщо вище 7,8 ммоль/л, мова йде про цукровий діабет. На відміну від цього, максимальні значення нижче 8,9 ммоль/л і двогодинні значення нижче
6,7 ммоль/л норми. Значення в проміжному діапазоні підозрілі і потребують перевірки. Щоб не поставити під загрозу тесту на провокацію для пацієнта з діабетом, маніфестний діабет попередньо виключається за допомогою "щоденного профілю глюкози в крові".
Оцінка орального впливу глюкози в крові після введення глюкози Концентрація глюкози в крові в капілярній крові в ммоль/л 0 '
Тест на толерантність до глюкози також може бути використаний для виявлення (і запуску) патологічної гіпоглікемії з різних причин (функціональний гіперінсулінізм; аденома острівцевих клітин), при якій максимальні значення після перорального введення глюкози залишаються нижче норми. Первинний цукровий діабет можна розділити на чотири стадії: 1.
Потенційний діабет: відсутність метаболізму діабету, скринінгові тести діабету нормальні, але сімейне навантаження; приблизно 25% нашого населення
Прихований діабет: при стресі, вагітності або надмірній вазі тест на толерантність до глюкози також може бути позитивним.
Безсимптомний («субклінічний» або «хімічний») діабет: тест на толерантність до глюкози позитивний; близько 8% населення.
Клінічний діабет: маніфестний діабет; близько 3% населення. Гіперглікемія і, можливо, глюкозурія. Скринінгові тести на діабет не потрібні. У цьому випадку тести можуть загрожувати пацієнту!
Глікований гемоглобін Глікований гемоглобін продукується неферментативним додаванням глюкози до аміногруп лізину в пептидному ланцюзі або до N-кінцевого кінця субодиниць та . Транспортер глюкози в мембрані еритроцитів забезпечує швидкий обмін глюкози, завдяки чому в еритроцитах присутня та ж концентрація глюкози, що і в плазмі. Альдози реагують із вільними аміногрупами, утворюючи основу Шиффа. Перегрупуванням Амадорі на другому етапі залишок глікозилу незворотно ковалентно фіксується (рис. 1).
Конкретне визначення глікованого гемоглобіну (HbA1) у гемолізаті можливо після попереднього поділу фракцій гемоглобіну за допомогою іонообмінної хроматографії. Цей процес поділу заснований на електростатичній взаємодії іонів у досліджуваному зразку з іонообмінником, який містить групи протилежного заряду, ковалентно закріплені на нерозчинному матеріалі-носії (матриці). Протівоіони, що взаємодіють з іонообмінником, можна обміняти на інші іони з тим самим зарядом. Залежно від заряду іонообмінника, іоніти),
Іонообмінники) з негативним зарядом. Як і майже всі білки, гемоглобін несе електричний заряд у водному розчині, який зумовлений кислими або основними групами бічних ланцюгів амінокислот, а також кінцевими аміно та -карбоксильними групами. Чистий заряд молекули є результатом суми позитивних і негативних індивідуальних зарядів і залежить від значення рН білкового розчину. РН, при якому кількість позитивних зарядів таких
негативна і при якій молекула здається незарядженою назовні, називається ізоелектричною точкою. Нижче ізоелектричної точки (ІП) заряд молекули є позитивним (катіон), і тому він може бути пов'язаний з катіонітом, тоді як над ІП є чистий негативний заряд (аніон), що дозволяє білку зв'язуватися з аніонітом. Електростатичний ефект між білком та іонообмінником може бути послаблений або навіть повністю розчинений шляхом зміни значення рН або збільшення концентрації солі (конкуруючих іонів). У цьому експерименті для виділення різних субфракцій гемоглобіну використовується слабокислий катіоніт. Аликвоту гемоглобіну змішують із суспензією іонообміну. За вибраних умов (рН = 7,0) зв’язаний лише нормальний гемоглобін, тоді як глікозильований гемоглобін (HbA1) залишається в супернатанті. Різна адсорбційна поведінка цих двох
глікозильований і нормальний гемоглобін, який створюється шляхом незворотного зв’язування глюкози з аміногрупою білка, зі незмінним рН, зміщуючи загальний заряд у негативний діапазон і, таким чином, зменшуючи сили зв’язку між глікозильованим гемоглобіном та іонообмінником.
Загальні питання метаболізму глюкози; Регулювання рівня глюкози в крові; Вплив інсуліну та антагоністів інсуліну; Хімія зазначених гормонів; Зміни метаболізму при цукровому діабеті; Гемоглобін (будова, функції, крива зв’язування кисню, ефект Бора, ефект буфера, патологічні зміни: кількісні та якісні гемоглобінопатії, серповидноклітинний гемоглобін); Міоглобін.
ЦІЛЬ ЕКСПЕРИМЕНТІВ
Тест на толерантність до глюкози Після того, як досліджуваний прийняв певну кількість глюкози всередину, концентрація глюкози в крові швидко зростає після того, як глюкоза розсмоктується з просвіту кишечника. Концентрація глюкози в крові нормалізується через певний час після початку фізичних вправ. Цей процес повинен супроводжуватися визначенням концентрації глюкози в капілярній крові. Спостережуване збільшення та зниження концентрації глюкози в крові слід показати графічно, а потім інтерпретувати.
Глікований гемоглобін
комерційний набір реагентів, що містить готову до використання суспензію слабокислого катіоніту. Метою є визначення кількості глікозильованого гемоглобіну як у власній крові, так і у зразку зі збільшеним значенням (кров діабету).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТУВАННЯ ТА ПРОТОКОЛ ТЕСТУВАННЯ
Принесіть список: халат, калькулятор
Підготуйте п’ять пробірок Еппендорфа з 0,5 мл хлорної кислоти (0,35 моль/л) кожна. Через 30, 60 та 90 хвилин з кінчика пальця за допомогою капілярної піпетки видаляють 0,05 мл капілярної крові, капіляр поміщають у пробірки Еппендорфа з хлорною кислотою і добре струшують (депротеїнізація!). Після взяття 0,05 мл капілярної крові для визначення значення глюкози в крові натще (зразок 1), досліджуваний випиває розчин 75 г глюкози в 300 мл соку. Час реєструється. Через 10 хвилин після взяття останньої проби та її депротеїнування хлорною кислотою її центрифугують протягом 4 хвилин на максимальній швидкості. Супернатанти ретельно декантують, переносять у нові пробірки Еппендорфа і знову центрифугують протягом 4 хвилин. Супернатанти використовуються для визначення глюкози в крові (розділ С.3.). Будь ласка, позначте судини номером групи, а також номером зразка та передайте решту зразків помічнику після випробування!
Глюкозний реагент: Глюкозооксидаза (GOD) окислює глюкозу до глюконової кислоти з утворенням H2O2. Перекис водню окислює донор водню (фенол та 4-амінофеназон) до барвника D в реакції, каталізованій пероксидазою (POD):
БОГ глюкоза + H2O + O2 глюконова кислота + H2O2
Кількість утвореного барвника D є мірою кількості перетвореної глюкози. Оскільки молярний коефіцієнт екстинкції D залежить від умов випробування, виміряна екстинкція (довжина хвилі 500 нм) пов'язана з екстинкцією стандартного значення глюкози.
Проведення визначення рівня глюкози в крові
Необхідні рішення знаходяться на робочому столі: I:
Глюкозний реагент фосфатний буфер, 0,10 моль/л, рН = 7,0; 50 мкг хромогену (0,75 ммоль/л фенолу та 0,25 ммоль/л 4-амінофеназону); > 1,5 КУ/л POD; > 15 КУ/л БОГ; > 2,0 КУ/л мутаротази
Стандарт глюкози (5,55 ммоль/л).
Розведіть 50 мкл рівня глюкози в 0,5 мл хлорної кислоти. Використовуючи підготовлені зразки (розділ С.1.), Підготуйте партії згідно з таблицею нижче, ретельно перемішайте і залиште стояти 10 хвилин при кімнатній температурі.
Калібруйте фотометр при 500 нм, визначайте поглинання еталону та зразків по відношенню до порожнього значення.
Глікований гемоглобін 1.
Береться кров і готується гемолізат: Помістіть 200 мкл реагенту для гемолізу в посудину Еппендорфа (Eppi), позначену "Е"; Зберіть кров за допомогою капілярної піпетки 50 мкл; Негайно додайте заповнений капіляр до Епі і добре перемішайте, щоб кров вимилася; Дайте постояти 5 хвилин.
Підхід HbA1 Підходи готуються паралельно з гемолізатами із стандартної крові (Eppi "S"), аутологічної крові (Eppi "E") та діабетичної крові (Eppi "D"). Перед піпетуванням енергійно струсіть гемолізат! Внесіть піпеткою по 100 мкл гемолізату в кожну з іонообмінних пробірок; Позначте пробірки ("S", "E" або "D") і вставте сепаратори (залиште приблизно 1 см над рідиною); Інкубуйте протягом 5 хв і енергійно струшуйте з інтервалом в одну хвилину; Обережно віджимайте рідину сепаратором і вимірюйте поглинання [intТочка 4 (E1)].
Загальна порція Hb У три паралельні партії 20 мкл гемолізату "S", "E" або "D" поміщають у пробірку з 5 мл дистильованої води. змішані. (Не забувайте буквене позначення)! Дайте постояти 5 хв, а потім виміряйте поглинання [intPoint 4 (EG)]
Вимірювання зразків крові при = 405 нм (фотометр регулюється щодо води).
Тест на толерантність до глюкози (проведення експерименту) Короткий зміст Виконайте пункти 1-4 негайно, а потім читайте далі ! Експеримент 1 1) 2) 3) 4)
Додайте 500 мкл хлорної кислоти до 4 Eppis (з маркуванням 0,30, 60,90 хв.) І заберіть кров. Для цього використовуйте капіляр. (Капіляр повинен бути повним, без бульбашок повітря). Закиньте капіляр у посудину з часом "0 хв" і негайно добре струсіть. Випийте колу, запишіть час.
Експеримент 2: Можна проводити в будь-який час (час 30 або 60 хвилин від експерименту 1 підходить).
Частина B) 21) Наповніть три пробірки кожною по 5 мл води (з написом "E", "S", "D") 22) З Eppis ("E", "S", "D") по 20 мкл гемолізату в пробірки, наповнені водою
дати. 23) Добре перемішайте і дайте постояти 5 хвилин. 24) Ще раз виміряйте поглинання проти води при 405 нм.
Після прибирання, будь ласка, не викидайте пробірки із стандартом глюкози, глюкозним реагентом та реагентом для гемолізу. Усі інші посудини для зразків утилізуються у передбачених посудинах для відходів крові.
ОЦІНКА І ОБГОВОРЕННЯ ПОМИЛОК
Тест на толерантність до глюкози Введіть виміряну абсорбцію та результати визначення глюкози у наступну таблицю та намалюйте криву. Як ви інтерпретуєте результати?
5Е500 концентрація глюкози в крові (ммоль/л)
Концентрацію глюкози в крові розраховують наступним чином:
Гліколізований гемоглобін Внесіть виміряну абсорбцію в наступну таблицю, визначте коефіцієнт F та обчисліть відсоток частки HbA1 у загальному гемоглобіні аутологічної та діабетичної крові. Частка HbA1 у стандартній крові становить 6,8%.