Пероральна інтубація дорослих даніо Модель для оцінки поглинання біоактивних сполук у кишечнику
Резюме
Протокол описує зондування дорослих даніо з біологічним методом; потім розібрати та підготувати цитометрію, конфокальну мікроскопію та qPCR кишечника. Цей метод дає можливість управління біоактивними речовинами контролювати всмоктування кишечника та викликаний місцевий імунний стимул. Це важливо для вивчення динаміки кишечника при пероральній профілактиці.
Анотація
Вступ
У біомедичному контексті представляє інтерес модель, розроблена для перевірки біологічних ефектів сполук після інтубації через рот. Багато анатомо-фізіологічних особливостей кишечника зберігаються між білатеріанськими лініями ссавців та кісткових риб 11. Ця модель інтубації порожнини рота, пов’язана з подальшим аналізом, може бути інструментом для отримання уявлень про біологію людини, а також полем для випробування біологічних препаратів та інших речовин in vivo.
Протокол оральної інтубації може проводити один оператор, наприклад, успішно вводити до 50 мкл суспензії наночастинок білка вагою 1 г з високим рівнем виживання. Процес простий у налаштуванні та швидкий; За 1 годину можна інтубувати 30 риб. Протокол підготовки кишечника є ключовим для надання клітинних зразків та для подальшого аналізу. Наведені нижче приклади результатів, які демонструють використання протоколу для отримання даних щодо кишкового поглинання та якісної РНК для ізоляту qPCR. Протокол був би дуже корисний для тих, хто має відповідну модель для перевірки динаміки пероральної профілактики або інших сполук у кишечнику.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Всі експериментальні процедури даніо (Danio Rerio) були дозволені комітетом з етики Університету автономної медицини Барселони (CEEH № 1582) відповідно до міжнародних керівних принципів для досліджень на тваринах (. EU 2010/63). Всі експерименти з живими даніо проводили при 26-28 ° С.
1. Підготувати обладнання для інтубації ротової порожнини
- Помістіть приблизно 1 см тонкої силіконової трубки на 31-рікову голку Люера, щоб закрити кінчик голки.
- Відріжте 10 мкл стерильного наконечника піпетки для фільтрування (приблизно 2 см), візьміть тонший кінець і покладіть його над силіконовою трубкою як кришку. Переконайтеся, що кінчик голки стирчить з піпетки, щоб не травмувати тварину.
- Покладіть голку на шприц Luer Lock об’ємом 100 мкл.
ПРИМІТКА: Промити етанолом, а потім забуференним фосфатом фізіологічним розчином (PBS, див матеріалів) ретельно між процедурами.
(2) необхідні рішення
- Приготуйте 150 мг/л (для анестезії) або 300 мг/л (для евтаназії) розчину етилового 3-амінобензоату метансульфонату (MS-222) з водою з акваріума, де доглядають даніо. Наповніть невелику ємність 1 л розчину анестетика та тримайте його у провітрюванні.
- Наповніть ще одну невелику ємність 1 л акваріумної води без відведення риби MS-222 і підтримуйте її в повітрі.
- Зробіть 50 мл 1x PBS із 10-кратного стерильного вихідного розчину.
- Аналіз на цитометрію/виділення кишкової клітини Приготуйте достатню кількість свіжого 0,15% розчину колагенази типу IV для 1 мл на рибу з вихідного розчину або порошку в модифікованому середовищі орела Дульбекко (DMEM) з 1% об./Об. Пеніциліну та стрептоміцину (див. Матеріал). Зробіть аліквоти (1 на рибу) по 1 мл у 2 мл пробірках для центрифуги. Зберігайте темп при 4 ° C протягом 30 хвилин до розтину.
- Для фіксації конфокальної мікроскопії/зразка підготуйте 50 мл свіжого 4% розчину параформальдегіду (PFA) з буфером PBS або розморозьте основний розчин у морозильній камері до -20 ° C у витяжці з парою.
Попередження: PFA токсичний. Будь ласка, прочитайте паспорт безпеки, перш ніж працювати з ним. Слід носити рукавички та захисні окуляри, а розчини завжди залишати у витяжній шафі.
3. Виробництво флуоресцентної суспензії наночастинок
4. Анестезування даніо і інтубація ротової порожнини
5. Дисекція кишечника даніо
7. Підготуйте кишкові кріосекції до конфокальної мікроскопії
8.Підготовка кишечника до qPCR в реальному часі (RT-qPCR)
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Змішані статеві даніо (середня вага: 1,03 ± 0,16 г) успішно інтубували різними наночастинками рекомбінантних білків (тілами бактеріального включення) за допомогою нашого саморобного пристрою для інтубації ротової порожнини (Рисунок 1). Ми успішно провели оральну інтубацію та досягли низького середнього відсотка смертності (6,8%) (Таблиця 1). Риб-даніо інтубували або 30 мкл, або 50 мкл суспензій наночастинок, і розраховували смертність протягом 24 годин після інтубації. Експерименти проводились двома операторами, Р мав менше досвіду роботи з оральною інтубацією данио, ніж J. Результати показали, що навіть новий оператор міг самостійно провести експеримент з інтубацією ротової порожнини та легко досягти високого рівня виживання за допомогою цього протоколу. З нашого досвіду оптимальний розмір риби становить 1 г, але ми успішно інтубували рибу розміром до 0,5 г.
Для того щоб краще зрозуміти, чи передається флуоресцентна наночастинка IBs TNF eine (рекомбінантний білок цитокінів, наноструктурований як тіла включення), даніо дані нашим методом і всмоктуються в кишечнику даніо чи ні, ми провели цитометричний аналіз. Наночастинки (100 мкг/риба, 50 мкл) і PBS (контроль) перорально вводили даніо (шляхом інтубації), а кишечник розсікали через 5 годин і 24 години після інтубації. Загальні клітини кишечника готували з етапу 6 та аналізували шляхом виявлення сигналу емісії флуоресценції. Репрезентативні гістограми інтенсивності флуоресценції та точкові графіки відсотка флуоресцентних клітин показані на малюнку 2показано. Щільність флуоресцентних клітин значно вища в групі, інтубованій наночастинками, порівняно з контрольною групою через 5 год і 24 год (рис. 2А.). Відсоток флуоресцентних клітин значно вищий через 5 год (46,3%) та 24 год (43,0%) груп, інтубованих наночастинками (Рисунок 2B.).
Для подальшого вивчення того, яка частина кишкового шару бере участь у поглинанні наночастинок, ми провели аналіз конфокальної мікроскопії. Наночастинки (20 мкг/риба, 50 мкл) і PBS (контроль) орально інтубували на даніо, а кишку розтинали через 5 годин після інтубації. Зрізи кишечника були заморожені процедурою тканини після етапу 7(Малюнок 3)підготовлений. Конфокальні зображення флуоресцентних наночастинок у кишечнику показані на малюнку 3B.показано. Флуоресцентні наночастинки були знайдені в кишечнику даніо. Ми спостерігали флуоресценцію в епітеліальних клітинах, власній пластинці та клітинах м’язів.
Щоб перевірити, чи зможемо ми виділити високоякісну РНК за допомогою нашого протоколу, ми проаналізували РНК, витягнуту з кишечника, за допомогою біоаналізатора (тут також називаємо РНК-аналізатором). Рибки даніо інтубували перорально PBS (50 мкл) або наночастинками (20 мкг/риба, 50 мкл). Кишечник розсікали для екстракції РНК через 24 год після інтубації. У нас є сім зразків РНК для тестування за допомогою аналізатора. Ми виявили, що всі випробувані зразки РНК мали високі показники цілісності РНК в діапазоні від 7,9 до 8,9 (рис.4).
ілюстрація 1 : Пристрій для інтубації ротової порожнини. (А.) Зображення голки Luer Lock об'ємом 31 г на шприці об'ємом 100 мкл із силіконовою трубкою та кінчиком піпетки, закріпленими на кінчику голки. (B.) збільшене зображення частини голки. Чорна стрілка вказує на те, що кінчик піпетки перевищує кінець кінчика голки. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Малюнок 4 : Віртуальне гелеве зображення РНК-аналізатора показує РНК, витягнуту з 7 кишок данио, відсканованих після інтубації. Зразки 1 і 2 - це групи PBS, що інтубуються, а зразки 3 - 7 - інтубовані наночастинками. Номери цілісності РНК (RIN) вказані внизу від 7,9 до 8,9. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
| оператора | гучність | # Риба інтубірована | Середня вага (г ± SD) | # Смерті | Смертність (%) |
| Р. | 30 ΜL | 22-го | 0,88 ± 0,14 | 3 | 13.6 |
| Р. | 30 ΜL | 17-й | 0,93 ± 0,19 | 0 | 0 |
| J | 50 ΜL | 19-го | 1,23 ± 0,31 | 1 | 5.2 |
| J | 50 ΜL | 30-й | 1,08 ± 0,40 | 2 | 6.6 |
| Загалом | 88 | 1,03 ± 0,16 | 6-й | 6.8 | |
| SD: стандартне відхилення середнього значення | |||||
Таблиця 1: Порівняння смертності даніо, спричиненої двома операторами, що використовують протокол. Відображається ідентифікаційний код оператора, інтубований обсяг, кількість риби та вага риби в грамах (г).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Цей протокол є вдосконаленням раніше описаної техніки інтубації ротової порожнини Collymore et al. 4 нашого протоколу детально описує метод інтубації ротової порожнини та включає підготовку кишечника до подальшого аналізу. Наш метод покращує швидкість маніпуляцій з рибою, завдяки чому одна людина може виконувати весь протокол швидко і без особливих розбіжностей між операторами. Основна відмінність від нашого протоколу з попереднім полягає в тому, що ми оцінюємо успіх експерименту з оральною інтубацією не тільки шляхом спостереження за твариною за його самопочуттям (наприклад, відсутність кровотечі) та відсутністю витоку введеної рідини, але також шляхом перевірки прийому біоактивних наночастинок в кишечнику з подальшим аналізом (цитометрія, конфокальна мікроскопія та qPCR). Ми показуємо, що інтубовані наночастинки, мічені пенетрантом, були знайдені в кишечнику.
Обмеженнями нашого дослідження є розмір риби, оскільки ми не тестували введення у риб розміром менше 0,5 г та використання хімічного анестетика для заспокоєння тварин. Деякі автори використовують холодну воду (0-4 ° C) для знеболення даніо, але з точки зору добробуту тварин та європейської правової точки зору ми вирішили, що методом вибору буде MS-222.
Данио пропонує багато переваг перед іншими модельними системами, включаючи повний набір генетичних даних та наявні трансгенні лінії. Для імунологів трансгенні лінії (наприклад, SF Mpx: GFP та Tg Mpeg1: GFP) забезпечують місце для спостереження in vivo імунних клітин, таких як макрофаги та нейтрофіли 19, 20. Поєднання нашої оральної інтубації та подальшого аналізу з трансгенними лініями було б ідеальним для ідентифікації типів клітин, що беруть участь у поглинанні, транспортуванні та переробці пероральних вакцин, наночастинок та патогенних мікроорганізмів у риб.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори заявляють, що не існує конфлікту інтересів.
Подяка
Ця робота була підтримана грантами Міністерства науки Іспанії, Європейської Комісії та фондів AGAUR для NR (AGL2015-65129-R MINECO/FEDER та 2014SGR-345 AGAUR). RT має докторантський грант від AGAUR (Іспанія), JJ підтриманий докторським грантом від Ради стипендіатів Китаю (Китай), а NR базується на програмі Ramón y Cajal (RYC-2010-06210, 2010, MINECO). Ми дякуємо Dr. Торреальба за консультацію фахівців щодо виробництва білка, Н. Барба з "Servei de Microscopia" та Dr. М. Коста з "Servei de Citometria" Університету автономного університету Барселони за корисну технічну підтримку.