Підгострі церебральні мікрокрововиливи, викликані ін’єкцією ліпополісахаридів у протоколи щурів

Резюме

Ми представляємо протокол для індукування та виявлення MHCs, індукованих ін'єкцією LPS у щурів Спраг-Доулі, який може бути використаний у майбутніх дослідженнях патогенезу MHC.

Анотація

Церебральні мікрокрововиливи (ЦМГ) часто зустрічаються у пацієнтів літнього віку і корелюють з різними нервово-психічними розладами. Етіологія МГЦ є складною, і нейрозапалення часто розглядається як супутня подія. Тут ми описуємо підгостру модель MHC щурів, індуковану ін’єкцією ліпополісахариду (LPS), а також метод виявлення системної ін’єкції MHC LPS. є відносно простим, економічним та економічно вигідним. Основною перевагою ін’єкції ЛПС є його стабільність викликати запалення. МГЦ, індуковані ін'єкцією ЛПС, можна виявити за допомогою грубого спостереження, зважених гематоксиліном та еозином (ВІН), прусським фарбуванням Перла, подвійним фарбуванням Еванса (EB) та технологією візуалізації магнітно-резонансної чутливості (МРТ-SWI). Нарешті, в цьому звіті також обговорюються інші методи розробки моделей тварин із СМГ, включаючи їх переваги чи недоліки.

Вступ

Класичні церебральні мікрокрововиливи (МГК). Бачать периваскулярні крихітні відкладення продуктів розпаду крові, таких як гемосидерин, з еритроцитів у мозку 1. Згідно з дослідженням Rotterdam Scan, CMH були виявлені майже у 17,8% людей у ​​віці від 60 до 69 років та 38,3% у осіб старше 80 років. Поширеність MHC у людей похилого віку порівняно висока, і встановлена ​​кореляція між накопиченням MHC та когнітивною та нервово-психічною дисфункцією 3, 4. Нещодавно було повідомлено про декілька моделей MHC на тваринах, включаючи моделі гризунів, індуковані ін’єкцією стереотаксичної колагенази типу IV, трансгенні APPs 6, вплив β-N-метиламіно-L-аланіну, 7 та 8 гіпертонії, з MHCs, індукованими системним запаленням, як один із найбільш визнаних варіантів. Фішер та співавт. 9 вперше використав LPS, отриманий із Salmonella typhimurium, для побудови гострої моделі миші MHC. Згодом та сама група повідомила про розробку підгострої моделі миші MHC, використовуючи той самий підхід 2 .

LPS вважається запальним подразником, стандартизованим за допомогою внутрішньочеревної ін’єкції. Попередні дослідження підтвердили, що ін'єкція ЛПС може спричинити нейрозапалення, що відображається великою кількістю мікрогліальних клітин та активацією астроцитів у модельних тварин 2, 10. Крім того, встановлено позитивну кореляцію між активацією активації нейрозапалення та кількістю MHC 2, 10. На основі цих попередніх досліджень нам запропонували розробити модель MHC щурів шляхом інтраперитонеального введення LPS.

Досягнення технологій виявлення призвели до збільшення кількості пошуків на MHC. Найбільш широко визнані методи виявлення МНС включають виявлення еритроцитів за допомогою фарбування гематоксиліном та еозином (ВІН), виявлення заліза із заліза від прусського синього фарбування 9, виявлення відкладень синього кольору Еванса за допомогою імунофлуоресцентної (ЕВ) візуалізації та 7,0 тесла магнітно-резонансної томографії - Зображення, зважене на сприйнятливість (МРТ-SWI) 10. Дане дослідження спрямоване на розробку методу скринінгу на МГЦ.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі методи, описані тут, схвалені Комітетом з питань охорони здоров'я та з питань тваринництва (ACUC).

1. матеріали

  1. Підготовка ін’єкції LPS
    1. Додайте 25 мл дистильованої води до 25 мг порошку LPS, отриманого з Salmonella typhimurium, до кінцевої концентрації 1 мг/мл. Зберігайте ін’єкцію в стерильній пробірці при температурі 4 ° C.
      ПОПЕРЕДЖЕННЯ: LPS токсичний.
    2. Приготуйте 2% розчин ЕВ у 0,9% нормальному сольовому розчині, щоб підтримувати ін’єкцію ЕБ у робочій концентрації.

  1. Вводити LPS 10-тижневим самцям щурів Sprague-Dawley (SD) (середня вага: 280 ± 20 г) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції.
    ПОПЕРЕДЖЕННЯ. Якщо щурів купують у іншої організації, фаза адаптації не повинна бути менше 7 днів.

3. Ін’єкції ЛПС

  1. Введіть LPS внутрішньочеревно усім щурам у дозі 1 мг/кг і поверніть щурів у свою домашню клітку.
    Примітка: анестезія не потрібна.
  2. Через шість годин вводять таку ж дозу ін'єкції LPS щурам.
  3. Через шістнадцять годин вводять таку ж дозу LPS щурам.
    ПОПЕРЕДЖЕННЯ: Ін’єкція щурів SD з ЛПС у дозі 1 мг/кг може призвести до смертності 5%. Рівень смертності може ще більше зростати у молодих або старших щурів або вагітних щурів.
  4. Поверніть щурів у їх клітини після ін’єкції ЛПС та забезпечте доступ до їжі та напоїв за бажанням .
    ПРИМІТКА. Щури проявлятимуть виразну системну запальну реакцію, і тому дуже важливо, щоб клітини залишалися чистими протягом експерименту. Після першої ін’єкції ЛПС щурів слід часто контролювати (2 рази на день) щодо ваги, загального вигляду та погляду. Якщо щури починають демонструвати згорблену позу, небажання рухатися, значну втрату ваги (> 20%), фарбування порфірином, які вони гуманно евтаназували до дослідження 7 кінцевих точок ЕВ.

4. зразок

5.має забарвлення

Примітка: Ця процедура виконується за допомогою набору для фарбування очей.

  1. Промийте предметне скло в дистильованій воді.
  2. Плями в розчині гематоксиліну протягом 8 хв. промити в проточній воді протягом 5 хв.
  3. Диференціювати в 1% кислому спирті протягом 30 с. промити в проточній воді протягом 1 хв.
  4. Засіб для виведення плям у 0,2% аміачній воді (синя) або насиченому розчині карбонату літію протягом 30 с до 1 хв. промити в проточній воді протягом 5 хв.
  5. Змити 95% спиртом (10 занурень).
  6. Контраст з розчином еозину протягом 30 с до 1 хв.
  7. Дегідрат через 95% алкоголь, дві зміни абсолютного алкоголю, по 5 хв.
  8. Прозорий в ксилолі протягом 30 с.
  9. Підніміться за методом Лю 9 .
  10. Аналізуйте за допомогою флуоресцентного мікроскопа яскравого поля.
    ПРИМІТКА: еритроцити, звільнені від судин, які є складовими MHC, показані червоно-оранжевим фарбуванням під.

6.Російська синя забарвлення Perl

Примітка: Ця процедура виконується за допомогою набору для фарбування Perls.

  1. Гірки з дистильованою водою.
  2. Фарбування в реакційному розчині зі змішуванням рівних частин ферроціаніду та соляної кислоти протягом 10 хв.
  3. Зневоднюйте, стирайте, редагуйте та аналізуйте слайди, як описано в пунктах 5.7 - 5.10.

7. Подвійне фарбування ЕВ

Примітка: Ця процедура слідує кроку 4.1.3.

  1. Слайди з PBS три рази по 5 хв кожен.
  2. Інкубуйте предметні стекла з розчином 4 ', 6-діамідино-2-феніліндолу (DAPI) протягом 15 хв при кімнатній температурі.
  3. Промийте предметне скло розчином PBS три рази по 5 хв кожне і встановіть предметне скло розчином PBS-гліцерину.
  4. Проаналізуйте зображення на флуоресцентному мікроскопі. Поклади ЕВ позначені червоною флуоресценцією; ядра позначаються синьою флуоресценцією.

  1. Виконайте МРТ на 7-Т магніті, обладнаному активно екранованою градієнтною системою (внутрішній діаметр 16 см).
  2. Через сім днів після лікування анестезуйте щурів, вдихаючи 1,5-2,0% ізофлуранову маску, використовуючи систему анестезії ізофлураном.
  3. Ветеринарна мазь на очах щурів для запобігання сухості під наркозом.
  4. Тримайте щурів у положенні лежачи на спині та проводите МРТ-SWI сканування.
  5. Отримайте зважені скани SWI, використовуючи послідовність швидкого відлуння, використовуючи такі параметри: час відлуння (TE) 8 мс, час повтору (TR) 40 мс, кут перекидання = 12 °, поле зору (FOV) 35 мм × 35 мм, отримання матриця 384 × 384, щоб отримати зрізи товщиною 1 мм.
  6. Визначте MHC у MRI-SWI згідно з Greenberg et al. 11, який включав такі критерії: (1) діаметр ≤ 10 мм та інтенсивність плям (2) круговий, ізольований та слабкий сигнал.
  7. В кінці експерименту евтаназують щурів методом вуглекислого газу (швидкість потоку 6 л/хв) або 30% обсягу, що містить передозування.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

MHC можна виявити за допомогою різних підходів. Найвідомішими методами є: (1) загальне спостереження та оцінка поверхонь СМГ (показано на малюнку 1), верхня панель); (2) він має фарбування для виявлення еритроцитів (показано на малюнку 2а, верхня панель) або виявлення лізису червоних кров’яних тілець, отримане за допомогою фарбування прусським залізом (рис. 2А, нижня панель); (3) EB забарвлений для виявлення відкладень EB від витоків BBB (рис.3, ліва бічна панель); (4) Виявлення гіпоінтенсивних сигналів MRI-SWI CMH (рис. 4), ліва панель).

підгострі
Рисунок 1: Загальне спостереження за поверхнею СМГ. Верхня панель (AT): Модель щура; Нижня панель (): контрольна тварина. Червоні стрілки означають поверхневі СМГ. модифікований та повторно використаний з дозволу 10. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 2: зображення фарбування та прусського фарбування. Модель щура (AT) рефлексивний. Червоні кров’яні тільця були виявлені поза капілярами у верхній панелі, а точки заліза заліза від лізису еритроцитів виявлені в нижній панелі; () продуманий контроль над тваринами. Виявлені еритроцити та залізні точки заліза. Смуги шкали = 100 мкм (ліва панель A і B). Смуги шкали = 50 мкм (права панель A і B). Дозвіл змінено та повторно використано з 10. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 3. Двомітна флуоресцентна візуалізація відкладень EB. Ліва панель: модель щура. Виявлено кількість молекул ЕВ, що вирвалися з пошкодженого ВВВ (червоним кольором); Права панель: керування твариною. Молекул ЕВ не виявлено. DAPI синього кольору використовувався як кріпильний кронштейн. Шкала шкал = 100 мкм. модифікований та повторно використаний з дозволу 10. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 4. Зображення МРТ-SWI. Ліва панель (AT): Модель щура. Чорні стрілки означають гіпоінтенсивні сигнали від MHC; Права панель (): контрольна тварина. Гіпоінтенсивного сигналу не знайдено. Дозвіл змінено та повторно використано з 10. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Дослідження щодо СМГ збільшилися за останні роки. Однак механізм MHC залишається незрозумілим, що спонукає дослідників встановити тваринні моделі, які імітують цей конкретний стан. Наприклад, Hoffmann et al. розробили індуковану гіпоксією модель миші MHC, яка показує, що MHCs спричинені гіпоксією та порушенням цереброваскулярної авторегуляції 12. Рейтер та ін. 5 встановлено модель MHC у трансгенних мишей APP23, яка показала складчасту амілоїдну ангіопатію (CAA), важливу роль в етіології MHC. Фішер та співавт., повідомив про модель MHC миші, яка була індукована ін’єкцією LPS 9, яка виявила, що MHCs спричинені запаленням 2, 13, 14. Так само ми успішно розробили підгостру модель MHC у щурів SD із застосуванням ін'єкції LPS і виявили, що синтаза оксиду азоту (NOS), зокрема нейрони NOS та ендотеліальна NOS, беруть участь в етіології MHC, викликаючи запалення 10 .

Критичним етапом нашого протоколу є ін'єкція ЛПС, яка широко застосовується при розробці мишачих моделей нервово-психічних розладів, таких як депресія, 15, 16 шизофренії, 17 хвороба Паркінсона, 17 хвороба Альцгеймера 18 і 19 пріонна хвороба. Наскільки нам відомо, використання однієї дози (1 мг/кг) набагато вище, ніж у інших дослідженнях 15, 16, 17, 18, 19. Це може бути правдоподібною причиною смертності у цьому дослідженні. Модифікація дози LPS для індукції MHC може бути цікавою темою дослідження, оскільки різні дози або ін’єкції повинні були розкриватися за графіком, щоб впливати на кількість, розмір, розподіл та прогресування MHC 2. Раніше дослідження показало, що введення ЛПС у дозі 3 мг/кг у мишей індукувало гострий MHC 2 .

Незважаючи на те, що розробка різних моделей тварин сприяла дослідженню MHC, ми повинні визнати, що ці моделі тварин не імітують процес клінічних MHC. Наприклад, у нашій моделі щурів, подібно до моделі миші Фішера, MHC спостерігали в мозочку, але більшість спостерігали в долевих відділах (головним чином пов'язаних з CAA) та глибоких або інфратенторних місцях (переважно гіпертонія) 20, 21. ми не маємо пояснень цій розбіжності у розподілі, хоча Фішер та наша команда пояснюють це спостереження вразливістю мозочка судин до запалення.

У більшості клінічних випадків МНС виникають внаслідок більш ніж одного етіологічного фактора, хоча запалення відіграє важливу роль у його етіології. Таким чином, дослідження, що вивчають множинні фактори, що індукують MHC, замість чистих MHC, індукованих запаленням, можуть бути більш корисними для моделювання цього стану. Модель ін'єкції LPS може бути використана іншими основними факторами для вивчення механізму MHC. Наприклад, Fisher et al. здійснив попередній, все ще цікавий етап зі старінням мишей, яким вводили ЛПС, і продемонстрував, що старіння є ключовим фактором, який може зробити мозок більш імовірним індукуванням запаленням МНС 14. На наш погляд, важливістю даної моделі є її сумісність з іншими факторами на тваринних моделях для старіння 14, травми 22, а також хронічних захворювань, таких як гіперхолестеринемія 23, або трансгенних моделей, таких як гіпертонія.24 завдяки простоті, часу -ефективність та стабільність цього протоколу.

У пацієнтів з МНС спостерігається когнітивний спад, нервово-психічні прояви та запаморочення, які пов’язані з розподілом МНС. Одне з обмежень цього протоколу полягає в тому, що після ін'єкції ЛПС ми не могли виключити наслідки периферичного запалення на поведінку щурів, хоча зменшення соціальної та норової поведінки (внутрішня природна активність гризунів, що відображає знецінення повсякденної діяльності) спостерігається. На додаток до досліджень щодо шляхів вдосконалення нашого методу отримання тваринного моделю MHC, наприклад, метод ін'єкції LPS або додаток спостереження, гарантовано.

Тим не менше, ця проста, економічна та стабільна модель мишачого MHC, індукована ін'єкцією LPS, може бути використана дослідниками для з'ясування етіології MHC.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.