Підготовка та використання свіжоізольованих гладких м’язових клітин людського детрузора для
Резюме
Ми описуємо спосіб отримання свіжоізольованих гладких клітин детрузора з зразків сечового резервуару людини із застосуванням двоступеневої ферментативної процедури. Отримані життєздатні клітини DSM можуть бути вивчені різними одноклітинними методами, включаючи електрофізіологію фіксації амфотерицину-В, описану для виявлення фізіологічних та фармакологічних властивостей.
Анотація
Вступ
Наприкінці 1980-х - на початку 1990-х років група Ізенберга (Німеччина) опублікувала серію електрофізіологічних досліджень на свіжовиділених клітинах DSM, отриманих із сечових міхурів морських свинок 9, 10, 11, 12, 13 (таблиця1). Метод виділив два важливі спостереження, які допомогли захистити життєво важливі клітини і послужили початковим орієнтиром для інших. Вони проводили 1) попередню обробку ізольованих шматочків ДСМ розчином без вмісту Са 2/середовища перед обробкою ферментами та 2) перетравлення тканини розчином, що містить колаген. Ці два найважливіші етапи були включені у всі наступні варіанти процедур дисоціації клітин DSM (таблиця 1). В даний час у нашій групі використовується послідовний двоступеневий підхід до дисоціації папаїн-колагенази. Шматочки DSM спочатку обробляють ферментативним розчином, що містить папаїн, потім колагеном типу II, солюбілізованим у тому ж розчині (DS, розчин для розсічення/травлення). Цей підхід дає унікальні клітини DSM від різних видів, включаючи морських свинок, свиней, щурів, мишей і особливо людини (таблиця 1).
Взяті разом, описаний тут спосіб отримання одиночних клітин DSM, щойно виділених із сечового міхура людини, забезпечує життєздатні клітини, дуже придатні для електрофізіологічних досліджень з використанням різних конфігурацій техніки пластирного затиску, Ca 2 -візуалізація, імуноцитохімія, аналіз для проксимального судового розгляду на місці, і одноклітинна RT-PCR/qRT-PCR, а також передові методи молекулярної біології, включаючи аналіз мікрочипів, РНК-послідовностей та аналіз CHIP-seq. Використання методу перфорованого пластирного затиску амфотерицину-В забезпечує збереження природного клітинного середовища на відміну від інших конфігурацій. При запуску з використанням специфічних умов, описаних тут, призначених для скасування входів струмів K і Ca 2 в клітини DSM, струми, викликані напругою, виявляють властивості неселективних катіонних струмів, придатних для біофізичних характеристик. Та фармакологічних.
Протокол
Всі методи, описані тут, були схвалені комітетами Ради з оцінки інституцій Центру наук про здоров'я Університету Теннессі (Мемфіс, Теннессі, IRBMD 17-05714-XP) та Медичним університетом Південної Кароліни (Чарльстон, Південна Кароліна). IRBMD 00045232). Затверджені процедури дозволяють відбирати у пацієнта зразки сечового міхура на всю товщину (на 1 см на 1 см), що містять усі шари, включаючи слизову, гладку мускулатуру детрузора та серози, прикріплені до судин та жирової тканини). -донори, які проходять хірургічне часткове видалення сечового міхура. Пацієнтами-донорами є дорослі (досліджена на сьогодні вікова група: від 25 до 87 років), чоловіки чи жінки, із симптомами надмірно активного сечового міхура або без них (класифікується за оцінкою Американської урологічної асоціації I-PSS 41). Хірургічні процедури включають різноманітні захворювання, включаючи радикальну цистектомію при уротеліальній карциномі та аденокарциному. У таких випадках зібраний зразок резервуару сечі видаляють із ділянки пухлини.
1. Розтин тканини DSM та підготовка шматочків DSM без слизової
2. Ферментативна дисоціація шматків DSM, що дає свіжоізольовані поодинокі клітини DSM
3. Запис катіонних струмів, індукованих кроком напруги клітин DSM, з використанням всієї техніки корекції напруги комірок, перфорованої амфотерицином-B
4. Аналіз та візуалізація даних
Репрезентативні результати
Ферментативна дисоціація шматочків DSM забезпечує здорові свіжоізольовані клітини DSM, які зазвичай використовуються у функціональних та молекулярних дослідженнях, таких як: електрофізіологія пластирних затискачів та імуноцитохімія. Фігура 1 узагальнює етапи розтину та візуалізує установки, що використовуються для контролю температури етапів ферментативної обробки. Малюнок 2 ілюструє яскраві польові зображення клітин DSM, отриманих із трьох зразків сечового міхура людини, кожен від іншого пацієнта-донора. Здорові одиночні клітини DSM характеризуються веретеноподібною морфологією, чітко окресленими краями, чітко окресленим ореолом навколо клітини та напівконтрактильним (серпантинним) виглядом при перегляді під мікроскопом (див. Клітини DSM, позначені білими стрілками в малюнок 2). Вони також реагують на стимулятори скорочення, такі як карбахол мускаринового агоніста або високий K (60 мМ). Клітини DSM демонструють позитивну імунореактивність актину гладкої мускулатури, що підтверджує їх ідентичність (рис.3).
Рисунок 5: Струми катіонів цілих клітин, записані за допомогою метод затискання перфорованого пластиру амфотерицину-В в клітинах DSM людини. (AT) Схема протоколу кроку напруги ілюструє потенціал витримки -74 мВ та тривалість кроку напруги 400 мс від -94 до 96 мВ, виконану з кроком 10 мВ, потім повернуту до -74 мВ. (B, C) Репрезентативні сліди струму, а також графіки напруги щільності струму з двох різних клітин DSM людини, кожна з різних зразків сечового міхура/пацієнта-донора, отриманих за протоколом кроку напруги, описаного в (А). (D) Приклад поточного сліду, отриманого за протоколом рампи (графічно представлений у верхньому запасі як зміна напруги від -94 до 116 мВ протягом періоду 1 с при 0,21 мВ/мс, потенціал володіння становив -94 мВ). Праворуч на панелях (B-D), графіки відображають поточне співвідношення щільність-напруга для кожної записаної комірки DSM. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 6: TRPM4, 9-фенантрол-опосередкований блокатор каналів, інгібування індукованих напругою катіонних струмів у клітинах DSM людини. (AT) Показані репрезентативні струми, виміряні за протоколом кроку напруги, описаним на рис. 5А, для контролю, 9-фенантролу та промивання. () Короткий зміст нормалізованих реакцій на артеріальний тиск для контролю, 9-фенантролу та промивання у семи клітинах DSM (від семи різних пацієнтів-донорів). (VS) Різниця струму для 9-фенантрольного чутливого компонента, отриманого відніманням значень у присутності 9-фенантролу (30 М) від значень контролю, зазначених у (). Дані () та (VS) відображаються як засоби із позначками помилок для SEM, - представляє значимість (p-lt; 0,05, парний тест студента) для порівняння контролю проти 9-фенантролу при кожному артеріальному тиску. Знаки (AT) та () були відтворені з Христова та ін. (2016) 22 та використовується з дозволу. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Таблиця 1: Короткий огляд ферментативних підходів, що використовуються для виділення одиничних клітин DSM із сечового міхура різних видів.
| Типове рішення | Склад (в мМ) |
| DS (розчин для розтину/травлення) | 80 Na-глутамат, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 і 11 глюкози, рН доводиться до 7,4 (з 10 M NaOH) |
| DS-P (DS, що містить тата) | DS, що містить 1-2 мг/мл папаїну, 1 мг/мл дитиотреїтолу та 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну |
| DS-C (DS, що містить колаген) | Розчин DS, що містить 1-2 мг/мл колагену типу II, 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, 0 або 1 мг/мл інгібітора трипсину та 100-200 М Ca 2 |
| P (піпетка) | 110 CsOH, 110 аспарагінової кислоти, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA і 30 CsCl, рН доводиться до 7,2 за допомогою CsOH і доповнюється амфотеритином-B (300-500 г/мл) |
| E (позаклітинний) | 10 тетраетиламоній хлориду (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES і 10 глюкози, рН доводиться до 7,3-7,4 за допомогою NaOH або CsOH і 0,002-3 (2-3 мМ) ніфедипіну |
Таблиця 2: Склади розчину для дисекції/травлення (DS), а також розчинів для піпеток та позаклітинних процесів, що використовуються в експериментах із затисканням перфорованого пластиру.
Обговорення
Розкриття інформації
Подяка
Ця робота була підтримана грантами NIH-R01DK106964 та P20DK123971 Георгію Васильовичу Петкову. Автори дякують доктору Віктору Яроцькому та пані Сарі Максвелл за критичну оцінку рукопису. Ми також вдячні хірургам з урологічного персоналу MUSC та UTHSC: докторам Томасу Кіну, Гаррі Кларку, Стівену Севеджу, Рос Рамзу, Сандіпу Прасаду, Джонатану Пікарду, Крістоферу Ледбеттеру та Ентоні Паттерсону, а також жителям MUSC та UTHSC в урології: доктори Тейлор Воган, Семюель Уокер Ніклз, Метью Янг, Ерін Бернс, Джастін Еллетт, Райан Леві, Остін Янгер, Марк Каррін, Німа Барадаран, Олюгбемізола Маккой, Трейсі Типтон, Брайс Вайєт, Алісса Грейман, Сара Староста, Ара, Крістін Каллауей, Люсіль Кокс, Крістіан Деван, Ерін Хайтман, Бредлі Х'юстон, Стівен Легг, Роберт С. Ліббі, Коул Локлір, Крістен Марлі, Моніка О'Хенлон, Патрік Пробст, Синтія Шарадін, Елізабет Турвіль, Даніель Сапата за допомогу збір людської тканини.