Підшкірна інфузія ангіотензину II за допомогою осмотичних насосів викликає аневризми аорти у мишей

Резюме

Підшкірна імплантація осмотичних насосів пропонує зручний підхід для більш тривалої та послідовної доставки з'єднань. Цей підхід широко застосовувався для вивчення аневризм черевної та грудної аорти у мишей.

Вступ

Аневризми аорти демонструють постійне збільшення просвіту аорти, що передбачає розрив і, як правило, призводить до смерті. Це захворювання зустрічається як у черевній, так і в грудній аортальних областях, які називають аневризмами черевної аорти (AAA) та аневризмами грудної аорти (TAA) відповідно. Через неповне розуміння молекулярних механізмів та патофізіологічних процесів не існує перевіреної медичної терапії, яка могла б запобігти розширенню або розриву будь-якого типу аневризми аорти. Оскільки важко отримати зразки пацієнтів та провести експерименти безпосередньо на людях, дослідження, зосереджені на визначенні механізмів АААС, часто екстраполюються із тваринних моделей. Типово використана тваринна модель - це підшкірна інфузія ангіотензину II (AngII) мишам. Порівняно з іншими хірургічними підходами для індукції ААА у мишей, такими як пераортальна перфузія еластази або периаортальне застосування хлориду кальцію, які вимагають лапаротомії 1,2, цей метод не вимагає потрапляння в порожнину тіла і вимагає мінімальних хірургічних навичок 3,4.

Інфузія AngII у мишей призводить до глибокого розширення області грудної аорти, яке здебільшого обмежується висхідною аортою, яка є найпоширенішою областю для TAA у людей 19,22-26. Подібно до індукованих AngII AAA, TAA, індуковані під час інфузії AngII, також рекапітулюють багато функцій людських TAA. 25. Однак, на відміну від AngII-індукованих AAA, AngII-індуковані TAA не пов'язані з гіперхолестеринемією і не мають гендерних відмінностей.

Загальною метою підшкірної інфузії AngII у мишей є вивчення патологічних особливостей та молекулярних механізмів AAAS та TAA.

Протокол

Заява про етику: Дослідження мишей проводяться з дозволу Інституційного комітету з догляду та використання тварин Університету Кентуккі (номер протоколу IACUC: 2006-0009). Після укладання мишей передозують кетаміновим коктейлем (

1. Розрахунок суми AngII

Примітка: Цей протокол заснований на прикладі інфузійного AngII (1000 нг/кг/хв), який годували насиченою жирною кислотою дієтою протягом 4 тижнів у 4 чоловічих мишей рецепторів ЛПНЩ -/-.

  1. Перед підрахунком кількості AngII, необхідної для інфузії, зважте досліджуваних мишей.
  2. Використовуйте шаблон (Таблиця 1) для обчислення маси AngII, необхідної для експерименту. Використовуйте "Середню швидкість насоса" в інструкціях із використання насосів як "швидкість насоса", показану на кроці 4 шаблону. У шаблоні запису кроки 1-5 вручну, а кроки 6-10 обчислюються автоматично.
    1. На думку, миші отримуватимуть 1 г маси тіла під час інфузії 1000 нг AngII/кг/хв протягом 4 тижнів.
      ПРИМІТКА. Кожна миша має різний приріст маси тіла, який залежить від багатьох змінних, таких як напруга миші та дієта. Ми регулярно використовуємо "0" або "1 г" на основі власного досвіду попередніх досліджень.
    2. Обчисліть 300 мкл загального обсягу розчину AngII для кожної миші, оскільки кожному насосу потрібно приблизно 250 мкл.

2. Розчинення AngII

  1. Зберігайте ліофілізовані флакони AngII при -20 ° C. Перед відкриванням збалансуйте флакони AngII до кімнатної температури.
  2. Зважте розраховану масу AngII (7,3 мг, як у Таблиця 1 показана) у стерильній пластиковій пробірці.
    ПРИМІТКА. За індексом Мерка не використовуйте скляні пробірки для розчинення, оскільки водний розчин AngII має сильну спорідненість до зв'язування зі склом.
  3. Додайте розрахований об’єм стерильного сольового розчину (1200 мкл) до пластикової пробірки, що містить ліофілізований AngII, ковпачок, і перемішуйте шляхом інверсії, поки розчин не стане прозорим.
  4. Позначте номери мишей №1, №2, №3 та №4 на окремих стерильних пластикових пробірках із кришками (0,5-1,5 мл). Приготуйте розчин AngII під ламінарним капюшоном для кожної миші, виходячи з маси тіла, як на кроці 1.2 і Таблиця 1 розрахована.
    1. Наприклад, прокапати 3,6 мкл стерильного сольового розчину в пробірку №1, потім 296,4 мкл розчину AngII і перемішати, обережно піпетуючи вгору-вниз.
  5. Позначте номери мишей на пластикових пробірках кришками (4 мл, стерильні). Вони будуть використовуватися для інкубації насосів, як описано в кроці 3.13.

3. осмотичне наповнення насоса

7. Зображення аорт на обличчі

  1. Розрізають аорту поздовжньо через зовнішню та внутрішню кривизни дуги аорти та розрізають відкриті основні гілки, включаючи безіменну, ліву сонну артерію та ліву ключичну артерію. Шпилька аорти плоскою з зовнішньою адвентичною прокладкою поруч із чорним воском.
  2. Отримайте зображення обличчя аорти інтимної поверхні з однаковим збільшенням. Включіть лінійку в кожне зображення для калібрування, як показано в 4-й.

Репрезентативні результати

Описані в протоколі 4 миші-самці рецепторів ЛПНЩ -/- були евтаназовані через 4 тижні інфузій AngII. Аорти збирали, очищали та знімали для візуалізації розширень аорти. Як і в Малюнок 3 показаний, аорти мають різні властивості, включаючи розширення надниркової області (AAAs; 3А), розширення зони скелелазіння (TAAs; 3B) або розширення обох областей (наявність як AAA, так і TAA, Рис 3С), тоді як морфологія у миші була приблизно нормальною (3D). Розширення черевної аорти визначається кількісно, ​​вимірюючи ex vivo максимальну ширину області надниркових залоз, як показано червоною лінією в 3А показано. Для вимірювання висхідного розширення аорти аорти розрізали і відзначали, як у Малюнок 4 показано. На внутрішній поверхні вимірювали червоні лінії у висхідній області аорти (область, оточена th в 4А) для кількісної оцінки TAA. З тих пір у кожну картинку входить лінійка для стандартизації вимірювань в дві фігури 3 і 4 показано.

допомогою
. Рисунок 1. Репрезентативне зображення наповненого осмотичного насоса Кожен насос містить дві частини: основний корпус і сповільнювач потоку. Після заповнення корпусу насоса AngII вводиться сповільнювач потоку для герметизації насоса.

допомогою
Рисунок 2. Процес операції з імплантацією насоса (А) Миша поміщається в ламінарний капюшон з носовим конусом, який постійно вивільняє ізофлуран і кисень зібрані разом. (B) Прямий гемостат вводять у розріз, утворюючи підшкірний тунель; (C) Насос делікатний через вставлений шкірний розріз; (D) Після введення насоса розріз шкіри зшивається.

підшкірна
Рисунок 3 Зображення аорти (ex vivo) мишей, інфузованих AngII AngII 1000 нг/кг/хв вводили чоловічим рецепторам ЛПНЩ -./- миші 28 днів. (A) AAA, що супроводжуються тромбозом; Червона лінія (2,05 мм) показує вимірювання максимальної ширини аорти в області надниркових залоз. (B) висхідне розширення аорти (TAA) з приблизно нормальною абдомінальною аортою; (C) Глибокі розширення як у висхідній, так і в надниркової областях аорти (TAA і AAA); (D) абсолютно нормальна аорта без видимого збільшення області висхідної або надниркової аорти.

4.jpg "/>Малюнок 4. На знімках зображень областей грудної аорти мишей, інфікованих AngII AngII 1000 нг/кг/хв вводили чоловічим рецепторам ЛПНЩ настоюється. -/- миші протягом 28 днів. Область, окреслена червоною лінією, представляє висхідну область аорти, включаючи частину дуги аорти.

1 Необхідна доза 1000 нг/кг/хв
2 Почніть вагу тіла (найбільша миша) 24.8 G
3 Орієнтовний загальний приріст маси тіла 1 G
4-й Швидкість відкачки 0,25 ul/год
5 Кількість мишей 4-й
6-й Доза на годину для тварини 1518 рік нг
7-й Потрібна конц 6072 нг/вул
8-й На 300 мкл розчину 1,82 мг/300 мкм
ПОТРІБНЕ РІШЕННЯ
9 Загальний AngII (мг) 7.3 мг
10 Розчиняється у фізіологічному розчині та # 160; 1200 вул
миша вага тіла Коефіцієнт розведення Об'єм (ul) Вага насоса (г) Коефіцієнт заповнення
# (G) AngII Солоний Порожній Заповнені (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1,1443 1.3877 99
2 23,0 0,9 278,2 21.8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1.3904 100
4-й 21.8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1.3904 100
Коефіцієнт розведення = маса тіла миші/найбільша маса тіла миші
миша вага тіла Коефіцієнт розведення Об'єм (ul) Вага насоса (г) Коефіцієнт заповнення
# (G) AngII Солоний Порожній Заповнені (%)
1 24.5 1.0 296.4 3.6 1.1443 1.3877 99
2 23,0 0,9 278,2 21.8 1.1677 1,4145 100
3 24.8 1.0 300,0 0,0 1,1438 1.3904 100
4-й 21.8 0,9 263,7 36.3 1,1438 1.3904 100

Таблиця 1: Розрахунок 28-денної інфузії через осмотичні насоси.

Обговорення

Осмотичні насоси, що доставляють AngII підшкірно, є звичним підходом до індукції аневризм аорти у мишей. На основі даних багатьох лабораторій безперервні результати показали, що це надійний і відтворюваний метод для дослідження як AAA 3,4, так і TAA 22-26 у мишей. Отже, ця модель миші використовується як модель, яка рекапітулює кілька функцій аневризм аорти людини і забезпечує механістичне розуміння цих руйнівних захворювань.

Незважаючи на те, що старіння є фактором ризику розвитку ААА у людини, воно не систематично вивчалось для ААА, індукованих AngII, у мишей. Однак, схоже, частота та тяжкість індукованих AngII AAAs подібні у мишей у віці 8-48 тижнів 4,5,7. В даний час існує лише декілька досліджень індукованих AngII TAA у мишей у віці від 8 до 24 тижнів від 22 до 26, які не показали очевидних вікових відмінностей у формуванні TAA.

Таким чином, інфузія AngII досягається шляхом підшкірної імплантації осмотичними насосами для індукції аневризм аорти у мишей. Цей метод забезпечує AngII безперервно з визначеною швидкістю протягом певних періодів часу, які використовуються для вивчення як AAA, так і TAA.

Розкриття інформації

Публікацію цієї статті фінансує Alzet.