Реабсорбція солі та секреція калію дистальним нефроном - Нове бачення ролі

Хлое Рафаель 1, 2, 3, Марія Чавес-Каналес 1, 2 та Джульєтта Хадчуель 1, 2 *

1 Inserm UMR970, Паризький центр серцево-судинних досліджень, 56, rue Leblanc, 75015 Париж, Франція
2 Університет Парижа-Декарта, Сорбонна, Паризьке місто, Париж, Франція
3 Університет Париж-Дідро, Сорбонна, Паризьке місто, Париж, Франція

Дослідження рідкісної менделівської форми артеріальної гіпертензії, сімейної гіперкаліємічної гіпертензії (FHHt), призвело до значних успіхів у розумінні механізмів, що регулюють нирковий транспорт хлориду натрію. У деяких пацієнтів ця патологія обумовлена мутаціями, що впливають на гени, що кодують WNK1 та WNK4, дві серин-треонінкінази сімейства WNK (без лізину [K]). Клінічні ознаки, пов'язані з FHHt, є результатом, серед іншого, надмірної активності Na + -Cl - ко-транспортера, NCC. Багато команд були зацікавлені в регулюванні NCC WNK1 та WNK4. Однак отримані дані дуже часто були суперечливими. Нещодавно два наші дослідження допомогли частково пояснити ці суперечки та встановити нову модель регуляції NCC кіназами сімейства WNK.

Дослідження сімейної гіперкаліємічної гіпертензії (FHHt), рідкісного моногенного захворювання, дозволило досягти значних успіхів у розумінні механізмів регуляції реабсорбції NaCl дистальним нефроном. FHHt є результатом мутації в генах, що кодують WNK1 і WNK4, дві серин-треонінкінази сімейства WNK (без лізину [K]). Клінічні прояви FHHt зумовлені, серед іншого, підвищеною активністю Na + -Cl - котранспортера NCC. Тому кілька груп намагалися зрозуміти, як WNK1 та WNK4 можуть регулювати NCC. Однак дані часто були суперечливими. Два наших недавніх дослідження дозволили частково пояснити ці суперечки та запропонувати нову модель регулювання НКК з боку ННК.

WNK1-WNK4 та сімейна гіперкаліємічна гіпертензія

Есенціальна артеріальна гіпертензія (гіпертонія) - це складне захворювання, спричинене поєднанням генетичних факторів та факторів навколишнього середовища. Одним із найвідоміших факторів ризику є хронічний вплив дієти, занадто багатої на хлорид натрію [1, 2], але механізми, що відповідають за цю чутливість артеріального тиску до солі, ще не з’ясовані до кінця. Однак, завдяки складному математичному моделюванню, А. К. Гайтон запропонував у 1972 р., Що дефект переносу іонів в нефроні є причетним до всіх форм гіпертонії [3].

(→) Див. Новини Д. Еладарі та ін., РС n ° 5, травень 2010 р., сторінка 549

Схема дистального нефрона та клітин, що його складають. Нефрон складається з різних сегментів: проксимального канальця (червоним), петлі Генле (жовтого), дистального звивистого канальця (DCT, зеленого), сполучного трубочки (CNT, світло-блакитного) і каналу колектор (компакт-диск, темно-синього кольору). Ці останні три сегменти утворюють дистальний чутливий до альдостерону нефрон. DCT складається з одного клітинного типу, який експресує транспортер Na + -Cl -, NCC на його апікальній мембрані. Цей транспортер забезпечує електронейтральну реабсорбцію Na + та Cl -, без секреції K +. І навпаки, основні клітини CD реабсорбують Na + завдяки ENaC (епітеліальний натрієвий канал). Ця реабсорбція генерує електрохімічний градієнт, що сприяє секреції K + каналом ROMK (нирковий зовнішній медулярний калієвий канал). AQP2: аквапорин 2.

У 2001 році були виявлені перші мутації, відповідальні за FHHt [5]. Вони розташовані в генах, що кодують двох представників сімейства серинових треонінкіназ WNK (без лізину [K]), WNK1 та WNK4, які експресуються в нирці. Дивна назва цих кіназ зумовлена заміщенням каталітичного лізину, присутнього в субдомені II більшості відомих протеїнкіназ, цистеїном [6]. Багато команд вивчали регуляцію NCC кіназами WNK1 та WNK4 [34] (→).

(→) Див. Синтез Дж. Хаджуеля та ін., РС n ° 1, січень 2005 р., сторінка 55

Однак отримані результати часто були суперечливими, і чіткої та унікальної моделі, що пояснює механізм регулювання експресії та активності співтранспортера NCC ННК, так і не було встановлено. Дійсно, залежно від використовуваних моделей, в одних дослідженнях WNK4 та WNK1 представляли активізуючу роль NCC, а в інших - інгібуючу роль (див. Нижче). Дві останні публікації нашої команди дозволили нам почати пояснювати ці суперечності [7, 8]. Перший показує, що суперечливі результати досліджень, що вивчають регуляцію NCC за допомогою WNK1, походять від використання комплементарної ДНК (кДНК) WNK1 з інактивуючою мутацією [8]. Другий показує, що активуючий та інгібуючий вплив WNK4 на регуляцію NCC фактично присутній в одній клітці і що він модулюється внутрішньоклітинною концентрацією хлориду [7]. У цьому огляді ми повернемося до цих нещодавніх висновків і запропонуємо нову модель для пояснення ролі, яку WNK1 та WNK4 відіграють у регуляції транспорту NaCl та калію в нирках.

Суперечка WNK1

WNK1, активатор SPAK або інгібітор WNK4 ?

Були проведені перші дослідження щодо регулювання НКК з боку ННК в пробірці з використанням яєць Xenopus 4 або культур клітинних ліній. У цих моделях надмірна експресія WNK4 пригнічує мембранну експресію NCC і, отже, її активність [9, 10]. Цей спосіб регуляції залежить від активності кінази WNK4, починаючи з мутанта WNK4-кіназа загинула, яка більше не проявляє кіназну активність, більше не здатна інгібувати NCC.

Механізми, за допомогою яких WNK1 регулює NCC, довгий час залишаються суперечливими. Описано дві ізоформи WNK1 [11]: L-WNK1 (довгий-WNK1), який є всюдисущим і має каталітичну активність, і KS-WNK1 (специфічний для нирок WNK1), що є усіченою формою білка, що експресується конкретно в дистальній частині нефрону, і якому бракує кіназної активності. Далі ми зосередимося головним чином на L-WNK1, який є ізоформою, що бере участь у FHHt [12].

Кілька досліджень показали, що надмірна експресія L-WNK1, поодинці, в яйцеклітині ксенопу або клітинах нирок MDCK (Собача нирка Мадін-Дарбі) не впливали на активність НКК [10, 13]. Проте L-WNK1 може активувати NCC, інгібуючи WNK4. У той же час біохімічні дослідження показали, що L-WNK1 може активувати NCC незалежно від WNK4. Дійсно, L-WNK1 фосфорилює SPAK-кіназу (Кіназа, багата на пролін-аланін, пов'язана зі Ste20), який сам фосфорилює та активує NCC [14]. Таким чином, можливі два шляхи регулювання NCC за допомогою L-WNK1.

Суперечка WNK1: проста технічна помилка !

Отже, ці результати підтверджують результати, отримані на мишачих моделях. Вони підтверджують, що L-WNK1 є потужним активатором NCC в пробірці і у природніх умовах. Вони також показують важливість використання відповідного варіанту для вивчення функції гена, месенджер якого може зазнати декількох альтернативних зрощувань і, таким чином, породити кілька варіантів білка. Дійсно, у нашому дослідженні рівень активації NCC залежить від використовуваного варіанту, причому найвищий рівень отримується з варіантом, найбільш вираженим у нирках.

Суперечка WNK4 зумовлена різницею у внутрішньоклітинному хлориді

Дослідження яєць ксенопу або культивованих клітин показали, що WNK4 є інгібітором NCC і що це інгібування залежить від його активності кінази [9, 10]. Однак миші з інактивацією WNK4 демонструють зниження чисельності та фосфорилювання NCC [17]. Тому WNK4 буде активатором NCC у природніх умовах.

Друга серія експериментів поставила під сумнів отримані результати в пробірці. Мутації, виявлені в локусі WNK4 у FHHt у пацієнтів спостерігаються точкові мутації 7 [5]. Вони практично всі розташовані в невеликому білковому мотиві з десяти амінокислот, присутніх у всіх кіназах сімейства WNK. Функціональні наслідки цих мутацій довгий час залишаються невизначеними. Цей шаблон знаходиться нижче за течією домену намотана котушка, загалом описується як мотив, відповідальний за олігомеризацію білка (тобто пару) [18]. Отже, ці мутації можуть змінити взаємодію WNK4 зі своїми партнерами. Ця гіпотеза була підтверджена завдяки ідентифікації двох нових генів, мутації яких відповідають за FHHt [19, 20], KLHL3 (Келч-подібний 3) і Куллін3 [35] (→).

(→) Див. Новини Х. Луї-Діт-Пікара та ін., РС n ° 8-9, серпень-вересень 2012 року, сторінки.703

Білки, що виробляються цими генами, утворюють комплекс убіквітин-лігаза, в якому KLHL3 завербує субстрати, щоб бути убіквітінованими, що призводить до їх протеосомної деградації 8. WNK4 є одним із таких субстратів [21–23]. Мутації в WNK4, відповідальних за FHHt, перешкоджають його взаємодії з KLHL3, що призводить до збільшення кількості білка WNK4. Ці результати підтвердились у природніх умовах. Експресія WNK4 дійсно підвищена в нирці мишей, що несуть одну з мутацій WNK4 пов'язані з FHHt, і які представляють усі ознаки FHHt [22]. Отже, мутований білок WNK4 мав би ту саму активність, що і білок дикого типу. Ця гіпотеза перевірена у природніх умовах. Миші, які надмірно експресують дику форму WNK4, справді демонструють збільшення експресії та фосфорилювання NCC, а також FHHt [22].

Регулювання NCC за допомогою WNK4 модулюється концентрацією внутрішньоклітинного хлориду. AT. Активність NCC (транспортер Na + -Cl -) в ооцитах ксенопу, що надмірно експресують або не експресують WNK4. У стандартних умовах спільна експресія NCC з мишею (mWNK4) або людиною (hWNK4) WNK4 трохи зменшує або не змінює активність NCC відповідно (жовті смуги). Коли внутрішньоклітинна концентрація [Cl -] i хлориду знижується шляхом інкубації ооцитів у гіпотонічному середовищі, позбавленому хлоридів, активність NCC сильно стимулюється надмірною експресією WNK4 (фіолетові смужки). B. Фосфорилювання WNK4 як функція концентрації внутрішньоклітинного хлориду [Cl -] i. У стандартних умовах фосфорилювання WNK4 на серині в положенні 335 не виявляється вестерн-блот. Інкубація ооцитів у середовищі без хлориду сильно стимулює фосфорилювання цього залишку (за Базуа-Валенті та ін. [7]).

Той факт, що L-WNK1 може активувати NCC у яйцеклітині Ксенопус у стандартних умовах, тоді як для зниження внутрішньоклітинної концентрації хлориду ([Cl -] i) необхідно досягти того ж ефекту з WNK4, свідчить про те, що останній є більш чутливим до концентрації хлориду ніж L-WNK1. Цю гіпотезу було нещодавно підтверджено новим дослідженням. Теркер та ін фактично показали, що кіназна активність WNK4 поступово зменшується, коли внутрішньоклітинна концентрація хлориду зростає з 10 до 40 мМ, тоді як концентрація L-WNK1 стабільна при тих же концентраціях і не починає знижуватися, поки ця концентрація не досягне 60 мМ [27 ].

Чутливість WNK до концентрації хлоридів та регулювання секреції калію

Усі недавні дані, які ми представили, дозволили встановити нову модель регулювання НКЗ за допомогою WNK1 та WNK4. Вони узгоджують спостереження у природніх умовах і in vitro (рисунок 3). Тепер залишається визначити фізіологічні умови, в яких відбувається цей регуляторний шлях. Два дослідження припускають, що його можна використовувати для адаптації виведення калію у відповідь на зміну кількості цього елемента в раціоні.

Модель, запропонована для регулювання NCC за допомогою WNK1 та WNK4. У базальному стані (верхня панель) рівень фосфорилювання NCC (транспортер Na + -Cl -) підтримується за рахунок фосфорилювання SPAK (Кіназа, багата на пролін-аланін, пов'язана зі Ste20) частиною гетеромерів L-WNK1/WNK4 та гомомерів L-WNK1 та WNK4, які є фосфорильованими та активними. Інша частина цих мультимерів стає неактивною через зв'язування хлорид-іонів на рівні каталітичного домену кіназ. При прийомі дієти з низьким вмістом калію (середня панель) концентрація внутрішньоклітинного хлориду зменшується, що активує більшу кількість мультимерів L-WNK1/WNK4 та збільшує фосфорилювання SPAK, а потім NCC, а отже, кількість активних ко-транспортерів. І навпаки, після прийому дієти, багатої калієм (нижня панель), збільшення внутрішньоклітинної концентрації хлориду інактивує більшість мультимерів L-WNK1/WNK4, зменшуючи тим самим фосфорилювання SPAK та NCC, а отже і кількість котранспортерів до мембрани. Чорні смуги між молекулами WNK символізують домен HQ (невеликий карбокси-кінцевий блок, необхідний для взаємодії кіназ WNK між собою).

Кілька досліджень, проведених на щурах та мишах, показали, що експресія NCC змінюється залежно від вмісту калію в їжі: вона збільшується, коли дієта має низький вміст калію, а зменшується, коли дієта багата калієм [28] (Малюнок 3). Зниження експресії NCC в останньому стані збільшує кількість натрію, що надходить у сполучну трубочку (CNT) та кортикальний збірний проток (CCD), розташований нижче за потоком DCT. Це стимулює активність епітеліального протоку натрію (ENaC), що виражається в цих сегментах нефрона (Фігура 1). Реабсорбція натрію за допомогою ENaC є електрогенною. Це супроводжується виділенням калію через калієвий канал РОМК (нирковий зовнішній медулярний калієвий канал), що дозволяє виводити надлишок калію (Фігура 1). І навпаки, під час обмеження калію більша частина натрію реабсорбується NCC в DCT, що зменшує реабсорбцію натрію за допомогою ENaC та секрецію калію за допомогою ROMK. Цей механізм може пояснити гіперкаліємію, що спостерігається у пацієнтів з FHHt.

Модуляція концентрації внутрішньоклітинного хлориду ([Cl -] i) у дистальній звивистій трубці (DCT). У диких мишей калієвий канал Kir4.1 переробляє K + для насоса Na +/K + -ATPase і виробляє електрохімічний градієнт, необхідний для екструзії Cl - до базолатеральної мембрани. У мишей, мутованих для Кір 4.1, Активація цього каналу (права панель) призводить до збільшення [Cl -] i, а отже, до інактивації каскаду фосфорилювання WNK1/4-SPAK-NCC. Для спрощення схеми показано лише мультимери L-WNK1/WNK4. CLCK: хлористий канал; Kir5.1: калієвий канал, що утворює функціональний гетеродимер з Kir4.1. ГОВОРИТИ: Кіназа, багата на пролін-аланін, пов'язана зі Ste20; NCC: Na + -Cl транспортер - .

Висновки та перспективи

Тому всі ці дослідження дозволили узгодити дані у природніх умовах і в пробірці, отримані за останнє десятиліття щодо регулювання діяльності НЗК ННК. Перш за все, вони дали змогу зрозуміти, як шлях WNK-SPAK-NCC втручається у фізіологічних умовах, зокрема під час коливань споживання калію. Однак є ще багато моментів, які слід уточнити, щоб повністю зрозуміти складну роль, яку відіграють ці кінази у скоординованому регулюванні балансу натрію та калію. Найважливішим питанням є, зокрема, вимірювання внутрішньоклітинної концентрації хлориду та його коливань у цих різних умовах.

Посилання, що цікавлять

Автори заявляють, що не мають ніякого інтересу стосовно даних, опублікованих у цій статті.