Роль клітин-попередників ендотелію у хворих на осьову спондилоартропатію - PDF
1 Від Клініки нефрології та ревматології (професор, доктор медичних наук, Г.А. Мюллер) медичного факультету університету в Геттінгені Роль ендотеліальних клітин-попередників у пацієнтів з осьовою спондилоартропатією НЕВИЩАЙНА ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття докторської ступеня медичного факультету Університету Георга Августа zu Göttingen презентувала Марія Елізабет Фогт, уроджена Струве з Франкфурта-на-Одері Геттінген 2018
2 декан: проф. вип. нац. Х. К. Кромер Доповідач: спікер: третій спікер: Priv.-Doz. Лікар. мед. Сюзанн Патшан мед. Ротраут Меснер Проф. мед. Маргарет Шем Дата усного іспиту: 12 червня 2019 р
3 Цим заявляю, що підготував дисертацію з назвою Роль клітин-попередників ендотелію у пацієнтів із осьовою спондилоартропатією, і що я не використовував жодних джерел чи допоміжних засобів, крім зазначених мною. Оснабрюк,.
4 Зміст переліку рисунків. VI Перелік таблиць. VII Список скорочень. VIII 1. Вступ та завдання Вступ Спондилоартроз та аксіальна спондилоартропатія Визначення та історія Епідеміологія/перебіг захворювання Патогенез Клініка та курс Діагностика Фізичне обстеження Бали Критерії класифікації Лабораторія візуалізації Терапія/лікування АС Атеросклероз/серцево-судинний ризик у хворих з ендотеліальним васкулогенезом анігогенеза і енгіогенеза Опис експерименту; Виділення та культивування ЕРС та різних цитокінів Додаткові стимулятори та інгібуючі фактори на ЕРС число ЕРС в контексті патологічних станів Стан дослідження Матеріал та методи Збір колективів та даних пацієнта Визначення балів ЕРС та методи клінічного обстеження IV
5 3.4 Статистична оцінка результатів колективних досліджень пацієнтів Результати аналізу КУО, аналіз FACS Вазомодулюючі медіатори Підсумок обговорення курсу Додаток Бібліографія V
7 Список таблиць Таблиця 1: Перелік використовуваних витратних матеріалів 38 Таблиця 2: Короткий опис використаних інструментів/пристроїв 39 Таблиця 3: Список використаних реагентів 39 Таблиця 4: Описова статистика основних характеристик колективу пацієнтів 46 Таблиця 5: Клінічні вимірювання для оцінки рухливості хребта/перебігу захворювання 46 Таблиця 6: Описова статистика кількості CFU-EC у групі пацієнтів та контрольній групі 47 Таблиця 7: Перелік р-значень кількості CFU-EC, класифікованих за різними змінними/характеристиками 48 Таблиця 8: Описова статистика для кількості CFU-EC, класифікованих за статтю 49 Таблиця 9: Описова статистика кількості CFU-EC, класифікованих згідно з ASDAS 52 VII
8 Список скорочень acldl = ацетильований ліпопротеїновий анкілоз низької щільності = повне затвердіння суглоба AS = анкілозуючий спондиліт = анкілозуючий спондиліт ASAS = Оцінка спондилоартриту Міжнародне товариство ASDAS = Хвороба Анкілозуючого Спондиліту Оцінка axspa = Купання Спондилартропатії Бансилопатії. Функціональний індекс BASG = загальний показник анкілозуючого спондиліту ванни BASMI = індекс метрології анкілозуючого спондиліту ванни BSA = бичачий сироватковий альбумін BSG = швидкість осідання CAC = циркулююча ангіогенна клітина CD = кластер диференціації CEC = циркулююча ендотеліальна клітина, циркулюючі ендотеліальні клітини CFU = запальне захворювання кишечника утворююча одиниця CFU-EC = колонія, що утворює одиницю ендотеліальної клітини CPC = циркулююча клітина-попередник CRP = C-реактивний білок DMARD = антиревматичний препарат, що модифікує захворювання ECFC = ендотеліальна колонієутворююча клітина ELISA = імуноферментний зв’язок nt Аналіз Ентезит = запалення в області прикріплень сухожилля, зв’язок або капсул EC = ендотеліальні клітини ecfc = пізні нарости EPC EPC = ендотеліальна клітина-попередник VIII
9 ESSG = Європейська дослідницька група спондилоартропатії FACS = активоване флуоресценцією сортування клітин FBA = відстань від пальця до дна FLK-1 = рецептор VEGF-2 CD309 KDR HDL = ліпопротеїн високої щільності HLA = антиген лейкоцитарних клітин людини HSC = IL-6 гемопоетичних клітин = Інтерлейкін-6 KDR = рецептор домену вставки кінази KHK = ішемічна хвороба серця LDL = ліпопротеїни низької щільності LWS = поперековий відділ хребта MC = мієлоїдні стовбурові клітини MRT = магнітно-резонансна томографія NO = оксид азоту НПЗП = нестероїдні протизапальні препарати сольовий PDGF = фактор росту тромбоцитів PPI = інгібітори протонної помпи RA = ревматоїдний артрит SDF-1 = фактор похідного стромальних клітин 1a SpA = спондилоартрит, спондилоартропатія, спондилоартропатія TGF = трансформуючий фактор росту TPC = резидент клітини-попередника клітини IX VEGF = ендотеліальний фактор росту IX
11 Були досліджені наступні питання: 1. Яку роль відіграють ЕРС в осьовій спондилоартропатії? 2. Чи змінилася їх кількість чи функціональність порівняно зі здоровою контрольною групою? 3. Чи співвідноситься кількість або функція ЕРС із тяжкістю клінічного перебігу, застосовуваною медикаментозною терапією чи активністю захворювання? 4. Чи відіграють роль ЕРС у прогресуванні захворювання у окремого пацієнта? Сподіваємось, що результат нашого дослідження може вплинути на терапевтичні можливості або прогностичні параметри. 2
19 Значно несприятливими прогностичними факторами, за даними французького дослідження, є, крім кокситу, ШОЕ> 30, погана реакція на терапію НПЗЗ, обмежена рухливість поперекового відділу хребта, ранній початок захворювання (до 17 років), прояви органів або олігоартрит (Puchner 2012). Вживання нікотину та нехтування або лише періодична фізіотерапія також негативно впливають на курс. Смертність особливо вища через підвищений серцево-судинний ризик (Manger and Schulze-Koops 2012). 10
24 блокатори TNF-α викликають повну ремісію у понад 50% пацієнтів з осьовою спондилоартропатією (Barkham et al. 2009). Усі вимірювання прогресу (BASDAI, BASFI, BASMI) покращились через 24 і 102 тижні, а параметри запалення нормалізувались (Braun and Sieper 2007). За даними Харуна та співавт. (2013), схоже, терапія блокаторами TNF-α, особливо якщо розпочата на ранній стадії захворювання, зменшує рентгенологічний прогрес. Хірургічна терапія є лише варіантом для окремих пацієнтів з фізичними вадами, таких як пацієнти з нестійким хребтом. На додаток до фармакологічної терапії принципову роль відіграють немедикаментозні заходи, зокрема фізіотерапія. Дослідження показують, що регулярні ЛФК покращують фізичну функцію, біль та загальне самопочуття (Dagfinrud et al. 2008). 15-й
48 матеріалів Пристрій CO2 ІНКУБАТОР (нагрівальна шафа) Піпетки Eppendorf FACS-Калібур-морозильник Холодильник Мікроскоп: Мікроскоп з перевернутою культурою клітинних клітин Olympus IX-81 Стерильний стенд Чисте повітря тип CA/R Vortex Genie 2 Центрифуга Megafuge 1.0R: Rotixa/виробник Sanyo Eppendorf AG, Гамбург Becton Dickinson Sanyo Liebherr Leica Microsystems Olympus Biohazard Bodo Schmidt GmbH Heraeus instruments GmbH Hettich Таблиця 2: Короткий опис використовуваних приладів/приладів Речовина Каталожний номер виробника Biocoll 1,0777 г/мл Biochrom AG, Belin L6115 BSA ph 7,0 LabClinics SA K Dcular AcLDL L3484 Ендокультна базальна середня StemCell Technologies Inc Ендокультна добавка StemCell Technologies Inc FcR Блокуючий реагент Millenyi Biotec Fibronectin FLK = Миша-анти-людські системи досліджень, Міннеаполіс FAB 357F VEGFR2 Формалін Гідрохлорид Лектин з Ulex LIGMG-MEGA-MGG9 MG-MGG-M Антитіла до PE Джексон Іммунологічне дослідження, Балтимор, США Таблиця 3: Список використаних реагентів 39
50 Відстань до підлоги (FBA) Пацієнт нахиляється вперед, наскільки це можливо, з прямими ногами. Вимірюється відстань між кінчиком середнього пальця і підлогою. Це виміряне значення використовується для оцінки хребта, а також тазостегнових суглобів та ішіокруральних м’язів. Він часто використовується в клініці для моніторингу прогресу (Feldtkeller and van der Heijde 2005). Бічний нахил хребта Коли пацієнт стоїть вертикально, вимірюється відстань між підлогою і витягнутим кінчиком середнього пальця на тілі. Нове вимірювання проводиться з максимальним поперечним нахилом, ноги все ще прямі (без обертання!). Середнє значення формується з різниці між першим і другим значенням, виміряним для обох сторін (норма> 10 см), і використовується для розрахунку BASMI (van der Heijde et al. 2008). Рисунок 10: Схематичне зображення бокового нахилу хребта (докладніше про вимірювання див. Текст) Відстань щиколотки Цей показник використовується для оцінки рухливості тазостегнового суглоба. Коли пацієнт лежить, відстань між внутрішніми щиколотками вимірюється якомога ширшими ногами (витягнуті коліна, пальці вгору) (норма> 100 см). Це значення включено до BASMI (Feldtkeller and van der Heijde 2005). 41
51 Відстань до стінки козелка Це вимірювання використовується для оцінки кіфозу. Відстань між козелком та стінкою вимірюється, коли пацієнт стоїть вертикально спиною та п’ятами до стіни, а також є частиною BASMI (Feldtkeller and van der Heijde 2005). Малюнок 11: Схематичне зображення відстані трагусної стінки (для детальної інформації щодо вимірювань, будь ласка, зверніться до тексту) Поворот шийного відділу хребта Коли пацієнт сидить вертикально і дивиться прямо вперед, голова повертається якомога далі вправо і вліво (стандартно > 70). Кут між максимальним поворотом і нульовим положенням використовується для обчислення BASMI. Плечі не повинні повертатися (Фельдткеллер та ван дер Хайде, 2005). BASMI Індекс метрології анкілозуючого спондиліту у ванні формується на основі різних клінічних вимірювань для оцінки рухливості хребта та будь-яких обмежень. Сюди входять модифікована міра Шобера, поперековий нахил поперекового відділу хребта, максимальна відстань до щиколотки, відстань до стінки козелка, обертання шийного відділу хребта (для розрахунку див. Додаток). Цей індекс був введений в англійському місті Бат у 1994 році. У 42 році
3.4 3.4 Статистична оцінка Результати оцінювались за допомогою програми STATISTICA від statsoft. Спочатку дані перевіряли на нормальний розподіл за допомогою тесту Шапіро-Вілкса-З. Statistica використовує розширення цього тесту, описане Ройстоном 1992. Нормального розподілу зібраних даних немає. Крім того, описова статистика, зокрема із середнім значенням та стандартним відхиленням, була створена за допомогою STATISTICA. Оскільки нормального розподілу немає, для перевірки статистичної значущості використовували непараметричні методи. Для цього був використаний U-тест Манна-Уїтні. На відміну від нормального t-критерію з нормальним розподілом, він базується не на середніх значеннях, а на основі рейтингів. Суттєва різниця, тобто надвипадкова асоціація, була визначена зі значенням р нижче рівня значущості 0,05. Для ілюстрації взаємозв'язку між різними змінними коефіцієнт кореляції обчислювали за допомогою коефіцієнта Спірмена, як і рівень значущості. Для ілюстрації результатів були створені графіки коробки та діаграми розсіювання. 44
64 CFU-EC та куріння У курців спостерігається тенденція до зменшення кількості CFU-EC. Однак різниця між некурящими не є статистично значущою (р = 0,37). 70 Box-Whisker-Plot КОЕ та споживання нікотину Середнє значення КУО + SD: споживання нікотину відсутність споживання нікотину споживання нікотину відсутність середнє значення споживання нікотину середнє значення ± stdf. Середнє значення ± 1,96 * stdf. Надзвичайні екстремальні значення Рисунок 18: Кількість CFU-EC, класифікованих за споживанням нікотину 55
65 4.3 Аналіз FACS Для кількісної оцінки cepcs зразки пацієнтів готували та аналізували за допомогою пристрою FACS. Подвійні позитивні клітини для CD133 та FLK відповідають cepcs. У порівнянні зі здоровою контрольною групою тут не спостерігається суттєвої різниці. Середнє та медіана майже ідентичні (p = 0,69, N пацієнтів = 49, N контрольної групи = 10). Також не було продемонстровано статистично значущої кореляції між виміряними CFU-EPC та клітинами CD133 +/FLK +, виміряними FACS. 8 Ділянка боксу-вуса для подвійних позитивних пацієнтів клітин CD133/FLK та контрольної групи 7 6 CD133/FLK позитивні клітини середнє + SD: пацієнти - 0,97 + 1,65 контрольної групи - 0,75 + 0, пацієнти контрольної групи середнє середнє ± Stdf. Середнє значення ± 1,96 * stdf. Надзвичайні екстремальні значення Рисунок 19: cepcs (у%) у пацієнтів та контрольної групи. 56
66 FACS та активність хвороби Розбивка cepcs відповідно до активності хвороби, виміряна BASDAI, показала статистично незначущу тенденцію до більшої кількості cepcs з високою активністю захворювання (що відповідає BASDAI> 4; p = 0,1). FACS та гендерна класифікація cepcs, виміряна FACS відповідно до статі, не показала суттєвої різниці (p = 0,08). У пацієнтів чоловічої статі спостерігається тенденція до меншої кількості цепків. 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 Структура віскуса Кількість ЕРС (у%) з розбивкою за статтю ЕРС 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 Середнє + SD: Жінки 1,45 + 2,3 чоловіки 0,62 + 0,8 0,4 жінки жінки середнє середнє ± stdf. Середнє значення ± 1,96 * stdf. Рисунок 20: cepcs (у%), класифіковані за статтю 4.4 Вазомодулюючі медіатори Різниця між концентраціями різних вазомодулюючих медіаторів (VEGF, PDGF, TGF-β, ангіопоетин -1 та -2) у контрольній групі та у пацієнтів не була статистично значущою. 57