Розділювальні білки для мас-спектроскопії - LABO ONLINE
Окремі білки для мас-спектроскопії
Проста оцінка перетворюється на багаторазові вимірювання
Двовимірний капілярний електрофорез дозволяє онлайн-характеристику білків, розділених гелевим електрофорезом, за допомогою мас-спектрометрії. Цей метод описаний авторами у статті для LABO.
Гель-електрофорез для розділення білків за їх розміром був запроваджений 50 років тому [1] і став найбільш широко застосовуваним методом поділу у своєму роді. До протеїну або білкової суміші для аналізу додають додецилсульфат натрію (SDS), який утворює комплекс з білками. Отриманий негативний заряд SDS-білкового комплексу покриває внутрішній заряд білка і пропорційний розміру білка. Як результат, комплекси з однаковими співвідношеннями заряду до маси теоретично відокремлюються лише на основі їх розміру в електричному полі розділюючим гелем, як правило, поліакриламідним гелем (PAGE). Порівнюючи міграцію білків, що підлягають аналізу, з міграцією білків із відомими масами, невідому масу можна оцінити шляхом екстраполяції. SDS-PAGE використовується для визначення білкових мас і для розділення складних білкових сумішей на основі їх розміру.
Через відносно великі лабораторні та часові витрати, цей метод аналізу був оптимізований таким чином, що поділ відбувається вже не в розділювальному шарі, а в капілярному кварцовому капілярі (CE (SDS)). Цей капіляр має внутрішній діаметр в основному 50 мкм і заповнений розділяючим гелевим буфером. Це відрізняється від розділювального гелю, який зазвичай використовують у SDS-PAGE, тим, що використовуються водорозчинні лінійні або лише злегка зшиті полімери (замість зшитих полімерів), щоб мати можливість обмінюватися розділяючим гелевим буфером у капілярі [2]. Таким чином, поділ у капілярі може бути автоматизований та підвищена відтворюваність. Ще однією важливою перевагою відділення в капілярі є онлайн-детектування за допомогою УФ-поглинання або флуоресценції, що дозволяє робити кількісні твердження, а трудомістка фіксація та фарбування відокремлених білків, як у SDS-PAGE, більше не потрібні.
Теми в статті
CE (SDS) широко використовується в біофармацевтичній промисловості для тестування або характеристики чистоти та продуктів розпаду терапевтичних білків, таких як антитіла. Тому фокусом аналізу є виділення та кількісне визначення фрагментів, що виникають. Ідентифікація цих фрагментів є ще одним важливим моментом, оскільки вони можуть впливати на ефективність терапевтичного білка і, отже, на безпеку пацієнта.
Неточне визначення маси екстраполяцією
Ідентифікація виявляється величезною проблемою. Оскільки ефективність розділення CE (SDS) часто недостатня, це може призвести до того, що декілька фрагментів будуть заховані за піком. Це ускладнює присвоєння піків фрагментам за допомогою експериментів з додаванням шипів (додавання фрагментів, які вже були виявлені, та спостереження за збільшенням площі піків). Ідентифікація за розрахунковою масою білка шляхом екстраполяції також неможлива. Оскільки незалежно від того, чи відбувається поділ білка SDS у капілярі чи в полімеризованому гелі, визначення маси є неточним. Крім того, співвідношення зв’язаного SDS з білком може відрізнятися залежно від послідовності та структури білка, завдяки чому питома маса може ще більше відхилятися від реальної маси [3 - 4].
Неточне визначення маси не дозволяє чітко ідентифікувати домішки. Однак визначення точної маси цих фрагментів за допомогою мас-спектрометрії (МС) дозволяє зробити ідентифікацію. На жаль, пряме зв’язування СЕ (SDS) неможливе, оскільки сильно в’язкий гель-буфер для поділу містить декстран і нелеткі компоненти, такі як борат, - але перш за все поверхнево-активна речовина SDS, що призводить до повного придушення білка в процесі іонізації [5]. Збільшення масштабу цього методу СЕ (SDS) для можливого збору фракцій з подальшою підготовкою зразків поза мережею з огляду на сумісність з РС неможливе через малі обсяги та сильно в'язкий розділяючий гелевий буфер.
Інтернет-мас-спектрометрія за допомогою двовимірного капілярного електрофорезу
Наш підхід до онлайнового з'єднання МС заснований на переключенні другого вимірювального розділення у вигляді електрофорезу капілярної зони (CZE) між розділенням CE (SDS) та MS (рис. 1а) [6]. Це дозволяє несумісні з MS компоненти відокремлювати від аналіту. Для вирішення дуже стабільного комплексу білка SDS, необхідного для попереднього розділення, необхідна додаткова обробка зразків. Тому для цієї декомплексації SDS-білкового комплексу була розроблена онлайн-стратегія у другому вимірі поділу. Це складається з спільної ін’єкції органічного розчинника (тут метанолу) та катіонного поверхнево-активної речовини (тут цетилтриметиламмоній броміду (CTAB)), який розміщений до або після білкового комплексу SDS у капілярі другого розділювального виміру.
Зв'язок загального розділення CE (SDS) у першому розділовому вимірі з CZE у другому вимірювальному розділі відбувається за допомогою нанолітрового клапана з чотирма з'єднаннями (VICI). За допомогою цього клапана можна подати високу напругу (приблизно до 15 кВ), необхідну для розділення. Внутрішня петля зразка в діапазоні нанолітрів (4, 10 або 20 нл) дозволяє переносити ці дуже малі обсяги з одного виміру в інший.
Вимірювання фрагментів інтактного, термічно напруженого антитіла за допомогою двовимірної системи капілярного електрофорезу показано на малюнку 2. Можна було сформувати мас-спектри обох піків у розмірі CE (SDS). Стало очевидним, що під кожним піком СЕ (SDS) прихований не просто один, а кілька фрагментів. Для піку 1 (фіг. 2, синій) фрагмент 1С (23439,4 ± 1,5 Да) міг бути призначений легкій ланцюгу антитіла. Фрагмент 1B з різницею маси 103,7 Da до легкого ланцюга 1C може бути обумовлений C-кінцевим розщепленням цистеїну та 1A додатковим виведенням води. Для другого піку СЕ (SDS) (рис. 2, зелений) також було виділено три фрагменти антитіла. Маса піку 2С 47638,2 ± 0,7 Да була ідентифікована як фрагмент Fab. Елімінація двох останніх (T-H, ∆M = 238,2 Da) або трьох амінокислот (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) з елімінацією води з цього фрагмента Fab призводить до піків маси 2B і 2A.
Висновок та перспективи
За допомогою представленого тут двовимірного методу капілярного електрофорезу можна отримати онлайн-спектри мас раніше відокремлених СЕ (SDS) білків без подальшої підготовки зразків. Точні розміри дозволяють ідентифікувати забруднюючі речовини в біофармацевтичних продуктах та підтримати оптимізацію процесів виробництва відповідних ліків.
Література:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] Чжу та співавт. Анальний Чім Акта. 2012, 709, 21-31.
[3] Гуан та ін. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Rath та ін. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Rundlett et al. Anal Chem 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Römer та співавт. Anal Bioanal Chem 2019, 411 (27), 7197-7206.
АВТОРИ
Дженніфер Ромер 1
Крістіна Монтеалегре 1
Бернд Моріц 2
Стеффен Кіссіg 2
Крістіан Нойсюс 1
1 Аленський університет, хімічний факультет
2 F. Hoffmann-La-Roche Ltd, Базель, Швейцарія