Серцевий фенотип типових мишей TASK-1 та Pannexin-1 - Безкоштовний PDF
Серцеве фенотипування мишей з дефіцитом TASK-1 та паннексину-1 ІНАВГУРНА ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття наукового ступеня доктора медичних наук на кафедрі ветеринарної медицини Університету Юстаса Лібіха Гіссен Стелла Шульте (уроджена Петрич)
Представлено Інститутом фармакології та токсикології Університету Юстаса Лібіха Гіссен Науковий керівник: проф. Йоахім Гейєр та з клініки дитячої кардіології та пневмології університетської клініки Дюссельдорфа Науковий керівник: проф. Біргіт Доннер Серцеве фенотипування мишей із дефіцитом TASK-1 та паннексину-1 INAUGURAL DISSERTATION для здобуття наукового ступеня доктора медичних наук на кафедрі ветеринарної медицини Університету Юстаса Лібіха в Гіссені, представленого ветеринарним лікарем Stella Schulte (уроджена Петрич) з Фрайбурга Гіссена 2016
З дозволу департаменту ветеринарної медицини Гісенського декана університету Юстаса Лібіха проф. Лікар. Мартін Крамер Рецензент Проф. Йоахім Гейєр День суперечок Біргіт Доннер 10 травня 2017 року
Вступна хвиля перетинає ізоелектричну лінію (Mitchell et al., 1998; Chaves et al., 2003; Swynghedauw and Aubert, 2003; див. Малюнок 1.6). R R R R P S Q R R R R Кінець зубця T (кінець реполяризації) P S Рисунок 1.6: Ручне визначення кінця зубця T за допомогою миші. Модифіковано від Mitchell et al., 1998 Перетин зубця Т та ізоелектричної лінії визначається як кінець реполяризації. Q Фізіологічний пульс миші в стані спокою становить приблизно 550-620 ударів на хвилину (хв -1; Takuma та співавт., 2001; Kass та ін., 1998), що значно вище, ніж у людей із середнім значенням 70 ударів на хвилину (Doevendans et співавт., 1998; Silbernagel and Despopoulos, 2003). Інтервали PR, RR, QRS та QT у мишей відповідно коротші. Підводячи підсумок, можна сказати, що потенціали дії та анатомічна структура серця, а також експресія іонних каналів двох видів незначно відрізняються один від одного, але тим не менше по суті дозволяють передавати результати досліджень від миші до людини. Відповідно до сучасного стану знань, це, безумовно, найкраща з усіх можливих систем базових досліджень. 9
Вступ 1.5.3 Використання, розвиток та можливості вибивання мишей Попередня робота з розробки нокаутованих мишей принесла американцю Маріо Капеккі та двом британським колегам-дослідникам серу Мартіну Евансу та Оліверу Смітісу Нобелівську премію з медицини 2007 року. Поки що нокаутовані миші - це єдині істоти, створені в лабораторії за допомогою трансгенних методів, в яких один або кілька генів успішно та спеціально вимкнені. Вони втрачають свою функцію і дозволяють дослідникам робити висновки про свою роль у (спадкових) захворюваннях. З нашими двома лініями розмноження, мишами паннексин-1 і ТАСК-1, ми маємо таких нокаутованих мишей, доступних для експериментів. Тим не менше, остаточне питання щодо можливості передачі результатів для людей залишається завжди. 10
Вступ 1.5.4 Виробництво нокаутованих мишей 1. Культура клітин (ембріональні стовбурові клітини, ES) Рисунок 1.7: Виробництво нокаутованих мишей Модифіковано згідно з Graw, 2007 Цільовий вектор трансфікується в культуру клітин ембріональних стовбурових клітин та гомологічної рекомбінації включені в ДНК стовбурових клітин. В результаті проліферації змінених клітин нарешті створюється клітинна популяція зі зміненим геном, яка вводиться в бластоцисти миші. Ці бластоцисти вставляються в самок мишей шляхом перенесення ембріонів і переносяться ними. Миші, що народилися, несуть виключно нормальний (дикий тип) генетичний матеріал, або, як так звані мозаїчні миші, половина - дикого типу, а половина - генетично модифікована. Останні гетерозиготні. Зворотні схрещування з гетерозиготними мишами в кінцевому результаті призводять до гомозиготних нокаутованих мишей. 11
Вступ ES2-247 ES1-84 CE-395 CE-494 IS-169 CE-379 IS = Внутрішньоклітинна петля; ES = позаклітинна петля; CE = карбоксильний кінцевий кінець (цифри після кожного показують амінокислотні позиції трансмембранних доменів) Рисунок 1.9: Структурне порівняння трьох різних генів паннексину миші Модифіковано згідно з Penuela et al., 2009 Всі 3 гени паннексину миші мають 4 трансмембранних домени (кожен складається з 20 амінокислотних кінців), а також 2 позаклітинні петлі та внутрішньоклітинний карбоксильний та аміно-кінцевий кінці. Кінцевий карбоксильний кінець паннексину-2 набагато довший, ніж у двох інших паннексинів. 1.6.2 Експресія та функція паннексину-1 Паннексин-1 - єдиний з трьох білків паннексину, який можна виявити повсюдно (Barbe et al., 2006); його експресія особливо сильна в еритроцитах, ендотеліальних клітинах та астроцитах, де вони виділяються АТФ (Wang et al., 2007). Його експресія в серці миші (Ray et al., 2005; Nishida et al., 2008) збільшується під тиском (Nishida et al., 2008). На додаток до серця миші, паннексин-1 також можна виявити в сарколемі кардіоміоцитів собак (Долматова та ін., 2012). 15-й
Вступ На додаток до перехідного та рефрактерного періодів, ця робота також спрямована на аналіз вразливості мишей TASK-1 +/+ та TASK-1 -/- in vivo за допомогою запрограмованих октаполярних катетерів в електрофізіологічному дослідженні (EPU), може бути визначена внутрішньосерцева стимуляція. 25-й
Матеріал та методи 2 Матеріал та методи 2.1 Генотипування мишей Pannexin-1 та TASK-1 WT та KO 2.1.1 Підготовка ДНК із кінчиків хвоста Препарат ДНК із застосуванням набору DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden) проводили приблизно Кістки хвоста без кісток довжиною 3 мм, які видаляли з мишей, коли їх відлучували одночасно з розміщенням вух. Зразок тканини Розчинення клітинних стінок Зв'язування процесу промивання ДНК Рисунок 2.1: Принцип препарату ДНК, модифікований відповідно до керівництва набору DNeasy Blood and Tissue На першому етапі протеїназа K розчиняє клітинні стінки і таким чином звільняє їх ДНК. Потім різні буфери забезпечують оптимальне зв’язування ДНК з мембраною DNEasy спеціально поставлених пробірок. Два процеси промивання в кінцевому підсумку призводять до видалення непридатного матеріалу та інгібіторів ферментів, а чиста ДНК для елюювання готова до використання. Елюцію Готову до використання ДНК чистоту та концентрацію ДНК визначали фотометрично (NanoDrop 1000, Thermo Scientific, США). 26-й
Матеріал і методи видимого пучка Його збудження. Як правило, це було найбільш чітко видно на зображеннях, на яких амплітуда збудження передсердь була майже такою ж високою, як і шлуночка. Передсердя збудження його пучка (A) A Його початок: сигнал передсердя V початок: стимуляція шлуночків (V) Рисунок 2.6: Вимірювання пучка його в миші pannexin 1 +/+. Зондування (запис сигналу) за допомогою e3e4 Пучок His можна було розпізнати найкраще, коли амплітуди передсердного та шлуночкового збудження були такими ж високими під час внутрішньосерцевого запису. Якщо було виявлено пучок Його збудження, для кожної миші реєстрували шість послідовних серцевих скорочень щодо AH (початок стимуляції передсердь аж до пучка His), HV (пучок His до початку стимуляції шлуночків) та AV інтервал (початок передсердя до Початок камерного збудження). Ми провели це на шести мишах паннексину-1 та п'яти мишах TASK-1 обох генотипів. Середні значення на одну тварину оцінювали статистично. 38
Матеріал та методи 2.8 Телеметричні дослідження на мишах паннексин-1 +/+ та паннексин-1 -/- 2.8.1 Основні принципи У мишей довгострокові ЕКГ можна реєструвати лише за допомогою підшкірних або внутрішньоочеревинних передавачів. Вони є хорошим способом досягнення важко підтримуваних частот серцевих скорочень у мишей без впливу наркотиків (Bernstein, 2003; Berul 2003). Сигнали EKG реєструються двома електродами, передаються на пластини приймача, фільтруються матрицею (обидва DSI Data Sciences, Міннеаполіс, США) і, нарешті, стають видимими за допомогою комп'ютерної програми (LabChart 7). Рисунок 2.8: Наші телеметричні передавачі Передавачі, імплантовані нами підшкірно (модель ETA-F10 від DSI). 1 Самці та самки паннексину-1 WT та нокаутовані миші у віці 3-6 місяців вагою не менше 23 г використовували для підшкірної імплантації приблизно 1,6 г важкого передавача (DSI Data Sciences, Міннеаполіс, США) використовується. Як зазвичай у гризунів, усі тварини мали вільний доступ до їжі та води, доки не була введена анестезія. 1 http://www.datasci.com/products/implantable-telemetry/mouse-(miniature)/eta-f10 43
Матеріал та методи 2.8.2 Підготовка до імплантації передавача Як тільки тварини досягли стадії толерантності до анестезії після внутрішньочеревної ін’єкції кетаміну та ксилазину, ми закріпили їх у положенні лежачи на розігріваючій пластині (HAT 007, Minitüb GmbH, Tiefenbach). Ваші кінцівки були прикріплені до останніх за допомогою клейких смужок, тоді як ми обробляли очі комерційними мазями (наприклад, HYLO -Gel, Ursapharm, Saarbrücken) для захисту від зневоднення. Піддослідним тваринам постачали 0,5 л/хв кисню (Linde AG, Pullach) та 1,5 об.% Ізофлурану (Isofluran Actavis, Actavis, Munich) через латексну протигаз. Вони знаходились на пристрої для всмоктування з оргскла, спеціально виготовленому для цієї мети, який повинен був запобігти виходу повітря, що містить ізофлуран. Рисунок 2.9: Миша на операційному столі Миша на пристрої для всмоктування оргскла та нагрівальному килимку. Синій шматок латексу служив протигазом. Під час цих препаратів на водяній бані попередньо нагрівали стерильний передавач та 1 мл змішаний шприц, виготовлений з 5% глюкози та фізіологічного сольового розчину. 44
Матеріал та методи В кінці розслідування мишей вбивали, телеметричні передавачі виймали та очищали та дезінфікували за допомогою розчинів Гігазим та Гігасепт (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt). 2.8.5 Реєстрація довготривалих ЕКГ Аналогічно Крамеру та ін. (1998) ми почали реєструвати 24-годинні ЕКГ через десять днів після імплантації передавача. Щоб не викликати роздратування або поведінкових змін, під час запису тварини залишалися в окремих клітках. У дні запису ЕКГ подбали про те, щоб уникнути незвичного впливу людей та шумів у приміщенні для тварин, щоб не порушувався зворотний денно-нічний ритм. Всі пристрої, необхідні для реєстрації ЕКГ, такі як лабораторія живлення, ПК, монітор, платівки, коробка та різні кабелі живлення, були ретельно продезінфіковані перед тим, як потрапити у відповідну кімнату для тварин (Incidin Liquid, Ecolab, Monheim). Дані реєстрували за допомогою програмного забезпечення LabChart 7 (ADInstruments, Spechbach) та частотою дискретизації 1 кГц. ПК з програмним забезпеченням для аналізу Передавач вхідно-матричного приймача Рисунок 2.11: Схематичне зображення довгострокового запису ЕКГ Модифіковано від Kramer, 2000 47
Матеріал та методи 2.8.7.1 Плавання Експерименти з плавання (SV) розглядаються в експериментальній медицині тварин як рух з постійними навантаженнями, що призводить до субмаксимальних навантажень (Bernstein et al., 2003). Після телеметричного запису ЕКГ у стані спокою протягом п’яти хвилин тварини плавали індивідуально протягом наступних п’яти хвилин у клітці Макролон розміру II (висота 15 см, наповнена водопровідною водою при 37-39 С). Якщо окремі тварини були затоплені через виснаження, їх ненадовго підтримували вручну. ЕКГ реєстрували під час запливу та протягом 10-хвилинної фази після тренування, що миші поверталися до своїх клітин. Рисунок 2.12: Миша під час плавання з ручною підтримкою Для оцінки ми розділили спробу плавання на три фази таким чином: Таблиця 1: Час спроби плавання Тривалість фази (хв) Заняття 1 0 - 5 Відпочинок 2 5 - 10 Плавання 3 10 - 20 Відновлення 2.8.7.2 Вправа на біговій доріжці Використання роботи на біговій доріжці вважається золотим стандартом контрольованого серцево-судинного стресу у людей та інших великих ссавців 49
Матеріал і методи Підтримуйте швидкість ходьби з нахилом або без нього і закінчуйте, коли тварини виснажуються (Desai et al., 1999; Kemi et al., 2002; Massett and Berk, 2005; Niebauer et al., 1999). Наш перший протокол бігової доріжки I без нахилу (див. Табл. 2) обмежився прямим біговим маршрутом, під час якого швидкість постійно збільшувалась до настання втоми. Таблиця 2: Протокол I на біговій доріжці без нахилу (хв) Другий протокол II на біговій доріжці з нахилом був проведений не раніше 2 днів після першого, щоб дати тваринам час регенерації. На додаток до постійного збільшення швидкості, нахили у 5 кроків від 0 до 25 вводили кожні чотири хвилини (див. Таблицю 3). Швидкість (м/хв) Час (хв) Швидкість (м/хв) 0 2 20 13 2 3 22 14 4 5 24 15 6 6 26 16 8 7 28 17 10 8 30 18 12 9 32 19 14 10 34 20 16 11 36 21 18 12 38 22 Таблиця 3: Протокол бігової доріжки II з нахилом Час (хв) Швидкість (м/хв) Налаштування рампи (градуси) Час (хв) Швидкість (м/хв) Налаштування рампи (градуси) 0 2 0 16 10,2 20 2 3 "18 11,4" 4 3,3 5 20 12,5 25 6 4,5 "22 13,7" 8 5,6 10 24 14,8 "10 6,8" 26 15,9 "12 7, 9 15 28 16,5 "14 9,1" 30 17,7 "51
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Одразу після початку виснаження тварин повертали в клітини та реєстрували ЕКГ протягом 10-хвилинної фази відновлення. Пройдена відстань і швидкість під час втоми відзначалися для кожної миші. Фаза відновлення завжди проходила під спостереженням, і були відмічені будь-які відхилення. Рисунок 2.14: Миша на прямій біговій доріжці Якщо і протоколи бігової доріжки, і пов'язані з нею фази відновлення закінчились, тварин вбивали вивихом шийки матки. Потім їх використовували для визначення параметрів тіла. Як і при випробуванні з плавання, випробування на біговій доріжці були розділені на три різні секції для оцінки: Таблиця 4: Терміни проведення обох випробувань на біговій доріжці Тривалість фази (хв) Заняття 1 0 - 5 Відпочинок 2 5 - 10 Бігова доріжка 3 10 - 20 Відновлення 52
Матеріал та методи Завдяки високій частоті кадрів та хорошій просторовій роздільній здатності тепер також можливі ехокардіографічні дослідження серця малого миша з його високим пульсом. Ехокардіографію проводили за допомогою Vevo 2100 (FUJIFILM Visual Sonics Inc., Торонто, Канада) та лінійного перетворювача MS 400 з 18-38 МГц. У середньому 10 ударів серця за виміряне значення було отримано у 14 мишей з дефіцитом паннексину-1 +/+ - та 12. Рисунок 2.15: Ультразвуковий пристрій, яким ми користувались. 2 Мишей досліджували за допомогою ехокардіографії не раніше ніж через дванадцять днів після імплантації передавача. 2.9.2 Виконання ехокардіографії Індукцію анестезії проводили за допомогою 5% ізофлурану (ізофлуран Актавіс, Актавіс, Мюнхен) та 0,5 л/хв кисню (Linde AG, Пуллах) та зменшували до 1,5% ізофлурану, при цьому потік кисню залишався постійним Зберігати вплив анестезуючого газу на серцево-судинну систему якомога менше. Тварини повинні бути лише нерухомими. Для розслідування мишей клали на спину на нагріту пластину системи Vevo, попередньо розігріту до температури тіла, яка також служила рухомим столом, 2 www.visualsonics.com/vevo2100 54
Закладений матеріал і методи. Для цього її лапи закріпили за допомогою клейкої стрічки на датчиках для запису ЕКГ, голову помістили в протигаз, а температуру тіла контролювали за допомогою ректального датчика. Для того, щоб ультразвукові зображення були максимально відсутніми без артефактів, ми поголили мишей в області грудей (Контура, Велла, Дармштадт). Рисунок 2.16: Миша під час ехокардіографії Під час проведення ехокардіографії піддослідна тварина лежить на зігріваючому столі і отримує через маску газ для знеболення (ізофлуран). Для цілей моніторингу його кінцівки прикріплені до датчиків ЕКГ скотчем, а ректальний датчик (синій) реєструє температуру тіла. Для кращого огляду ми вибрали парастернальну довгу вісь як перше зображення. У цьому режимі реєстрували аортальний потік, діаметр кільця аортального клапана, довжину серця та М-режим для вимірювання товщини стінки. 55
Матеріал та методи Рисунок 2.17: Вимірювання діастолічної довжини серця та внутрішньої окружності серця по парастернальній довгій осі Зелений: ручне обведення ендокарда та вимірювання довжини серця в діастолі. Крім того, ми використовували цю установку для розрахунку маси лівого шлуночка серця за методом довжини площі, що призводить до найкращих результатів у людей та мишей (Collins et al., 2001; Devereux et al., 1986). Довжину лівого шлуночка вимірюють від верхівки ендокарда до мітрального кільця, а М-режим виробляють на рівні папілярних м’язів (Collins et al., 2001). З наступним другим налаштуванням, короткою віссю, ми зберегли 3 різні площини різання в режимі B в зонах вершини, центру та основи. Для цього ендокард обводили вручну у всіх трьох ріжучих площинах у систолі та діастолі. Рисунок 2.18: Коротка вісь у режимі В (лівий шлуночок) Чорний посередині = просвіт серця, навколо нього світло-сірий = ендокард, темно-сірий = міокард 56 Правий шлуночок
Матеріал та методи 2.11 Статистичні оцінки Дані всіх експериментів представлені як середні значення (МВт) ± стандартне відхилення (SD) та походять від певної кількості мишей (n), пояснених у кожному експерименті. Залежно від того, що підходить для питання, статистичну значимість розраховували за допомогою непарного t-критерію, одностороннього ANOVA або лінійної регресії. З р-значенням