Швидкий скринінг на ГРВІ-CoV-2 у слині за допомогою LAMP-Cas13; Новини-Медичні
Застереження: Ця сторінка є автоматичним перекладом цієї сторінки спочатку англійською мовою. Зверніть увагу, оскільки переклади створюються машинно, не всі переклади будуть ідеальними. Цей веб-сайт та його веб-сторінки призначені для читання англійською мовою. Будь-який переклад цього веб-сайту та його веб-сторінок може бути неточним і неточним, повністю або частково. Цей переклад подано на практиці.
Оскільки пандемія коронавірусу 2019 року (COVID 19) продовжує здійснювати свій вплив на світ, для контролю захворювання терміново потрібні методи швидких випробувань для виявлення РНК.
У новому документі, який з’явився в якості попередньої роздруківки на сервері medRxiv *, у грудні 2020 року описано підтверджений тест на нуклеїнові кислоти на зразках слини. В принципі, цей тест використовує ампліфікацію вірусної нуклеїнової кислоти з наступним опосередкованим Cas13 виявленням, у поєднанні з лізисом зразків твердими недорогими реагентами на полиці, без необхідності екстракції РНК.
Діаграма зразка DISCOVER для задоволення робочого процесу. Кредит зображення:
Цей тест має високу чутливість і специфічність і може бути використаний з декількома зондами CRISPR для пошуку людського гена або інших патогенів з цільовим вірусом. Цей тест SARS-CoV-2, який називається Discover (Діагностика із записом ферменту коронавірусу) не вимагає вилучення РНК. У цьому він несхожий на інші тести, засновані на CRISPR, такі як DETECTR та STOPCovid V2, які використовують світлодіоди та Cas12.
По-друге, з’ясуйте, що уникають зразків верхніх дихальних шляхів, базуючись на зразках слини. Описано використання зразків слини, щоб уникнути контакту медичного працівника та пацієнта. Вони узгоджуються з мазками з носоглотки в 97% випадків, коли це підтверджується за допомогою ланцюгової реакції зворотної транскриптази полімерази (Right-qPCR).
Проблеми в нормальному qPCR
Після зараження важким гострим респіраторним синдромом коронавірусом-1 (ГРВІ-CoV-2) настає безсимптомна фаза, коли вірус реплікується в заражених клітинах хазяїна і поширюється в інші відділи легенів та легенів. Волосяні клітини носових дихальних шляхів. Під час наступної фази виробництво вірусу стає експоненціальним, і людина стає інфекційним, хоча часто безсимптомним або безсимптомним.
Як тільки симптоматична фаза осідає, вірусне навантаження у верхніх дихальних шляхах зазвичай падає від свого піку, і рівень позитивності нуклеїнової кислоти також нижчий. Оскільки це фаза, коли дотримуються режими максимального контролю, багато тестів, швидше за все, дадуть хибнопозитивні результати.
Більше того, звичайні тести, такі як кількісна ПЛР (qPCR), вимагають складних установок, навченого персоналу і забирають багато часу. Тривалий час, необхідний для повернення результату тесту, робить ці тести непридатними для діагностики POC.
Необхідність швидких тестів POC
Найефективніший спосіб розірвати мережу передачі - це регулярна перевірка за допомогою короткої перевірки попередження про догляд (POC). Знову ж таки, швидке тестування може бути використано для виявлення позитивних результатів на рівні громади, що підтверджується більш конкретними тестами після передачі.
По-третє, наявність декількох або декількох методів управління могло б уникнути вузьких місць в діагностичній мережі електроживлення, надавши альтернативні набори для вибірки та контролю.
Ранні дослідники розробляли аналізи, які використовують qPCR без попередньої екстракції РНК, поряд з тепловим лізисом зразка. Також використовувались хаотропні агенти, інгібітори РНКази та відновники.
Перевірте принципи
Скринінг на основі CRISPR та ізотермічна ампліфікація - це методи, які можуть поєднуватися з прямим лізисом слини та взяттям проб для діагностичного тестування POC. Скринінг вірусної РНК за допомогою CRISPR залежить від використання направляючої РНК для активації Cas13 або Cas12, які є нуклеазами. Ці активовані ферменти отримують неспецифічні нуклеази проти одноланцюгової РНК (ss) або ДНК, таким чином розщеплюючи прив’язану молекулу-репортер і активуючи її вивільнення. Потім цей репортерський скринінг забезпечує тестове читання.
Перевагою управління на базі CRISPR є його висока специфічність. Однак використання лише нуклеаз Cas13 може затримати атомолярну чутливість до двох годин. Щоб подолати це, вони використали ізотермічне посилення (LED) із швидким та надзвичайним чутливістю, яке займає менше 20 хвилин для виявлення атомолярної чутливості.
За допомогою LIGHT перша вірусна РНК зворотно транскрибується в ДНК за допомогою комбінації зворотної транскриптази, петлі, що витісняє ДНК-полімеразу, та трьох пар праймерів. Потім ДНК подається на світлодіод.
У поточному дослідженні промотори РНК-полімерази були інтегровані в праймери VOYANT, щоб ампліфікована ДНК могла бути транскрибована в одноланцюгову РНК, яку ідентифікує зонд Cas13. Це призводить до посилення СВІТЛА до РНК або rLAMP. Оскільки кожен світлодіодний продукт буде транскрибований РНК-полімеразою, як тільки утвориться, знак Cas13 досягає піку за лічені хвилини
Однак ця техніка вимагає випрямлення для неспецифічного посилення, можливо результатом димеризації праймера. Це випрямлення було проведено з використанням зонда від деталей Cas13 для конкретної ідентифікації ампліфікованої нуклеїнової кислоти, таким чином, поєднання чутливості зі специфічністю.
Дослідники обрали N-лінію 1 праймерів, яка ідентифікує ген нуклеокапсиду (n) SARS-CoV-2, оскільки він має нижчий поріг часу і тому, що його амплікон досить великий, щоб вміститися в РНК напрямної Cas13. N-настроєний 1 набір праймерів має LOD 25 копій/мкл.
Які наслідки ?
Таким чином, поточне дослідження описує виняткову комбінацію двох механізмів посилення, що посилюють чутливість тесту, із специфічним зондом Cas13. Підсилення світлодіодів займає 20-30 хвилин.
Використання загальних, недорогих і легкодоступних реагентів для прямого лізису при кімнатній температурі спрощує процедуру. Дослідники зазначають, що легкість та комфорт збору слини для контролю COVID-19, швидше за все, призведе до посилення контролю за дієтою та частішого контролю, включаючи безсимптомний контроль. Це пов’язано з тим, що зразки слини мають порівнянні титри вірусу щодо мазків верхніх дихальних шляхів. Однак останні також можна використовувати з робочим процесом виявлення.
Дослідження підтверджує скринінг на ГРВІ-CoV-2 на контрольній модифікації на основі слини, використовуючи живий вірус, поряд з людським геном в якості контролю. Більше того, здатність використовувати різні нуклеїнові кислоти активує його адаптацію для виявлення різноманітних патогенів, таких як грип А і В.
Використання слини, скринінг не-РНК-екстракції та потенціал мультиплексного об'єктивного скринінгу робить його чудовим кандидатом для розвитку в діагностичних тестах РОС на COVID-19.
Подальша інтеграція з мікрофлюїдною тестовою платформою та пристроєм сприятиме частому тестуванню в школах та на робочих місцях як частину надійної інфраструктури для універсального тестування. "
Важливе повідомлення
medRxiv публікує попередні наукові звіти, які не підлягають спостереженню та, отже, не повинні вважатися переконливими, керувати клінічною практикою/поведінкою, пов’язаною зі здоров’ям, або трактуватися як визначена інформація.