Таємниця хвороби Гіршпрунга для науки
Хвороба Гіршпрунга, яка вражає кишечник, вже давно є загадкою. Сьогодні ми не тільки краще розуміємо його причини, але їх дослідження поновило наше розуміння розвитку ембріонів.
У осіб з хворобою Гіршпрунга товста кишка має погану рухову активність.
Берлін 1886, щорічний конгрес дитячих хвороб. Датський педіатр Харальд Гіршпрунг представляє випадок із двома дітьми, які померли в ранньому віці від дефіциту їжі, пов'язаного з хронічним запором. Під час розтину було виявлено, що їх товста кишка гіпертрофована: там накопичувався харчовий болюс, розтягуючи орган і викликаючи виражене запалення. Діагноз ставиться, але причина запору вдається уникнути Гіршпрунга, який не виявляє жодної видимої перешкоди для проходження болюсу. Хвороба, яка зараз носить його ім’я, вражає 1 із 5000 новонароджених у всьому світі. Отже, рідкісне захворювання. Проте його дослідження не тільки дозволило хірургічне лікування, яке призвело до лікування у 95% випадків, але було і залишається панірувальними сухарями для розуміння розвитку кишечника і навіть, загальніше, ембріона.
За п'ятдесят років після виступу Гіршпрунга жодного шляху лікування не склалося. Оскільки підозрювали, що причиною патології є збільшена частина товстої кишки, її видалення проводили без наслідків. Лише в 1948 р. Датський хірург Орвар Свенсон, тоді інтерн дитячої лікарні в Бостоні, поставив під сумнів аргументи, що виправдовують цю хірургічну процедуру. Дитину із хворобою прийняли до її палати та утримали в живих через колостому - шунтування збільшеної кишки, що веде безпосередньо до шкіри: товсту кишку, прикріплену до заднього проходу, зашили та залишили на місці. За допомогою манометричного аеростата Свенсон вимірював зміни тиску в колостомі і задньому проході: тоді як раніше збільшена товста кишка, пов’язана з колостомою, нормально стискалася, дистальна кишка, розташована трохи вище заднього проходу, здавалася інертною. Свенсон мав доказ, одну заплутану причину та симптом: саме накопичення хімусу - перетравленого харчового болюсу - спричинило гіпертрофію та запалення. Запор був через задушення, пов’язане з порушенням скорочувальної активності дистальної кишки.
Тому Свенсон запропонував зробити зворотну операцію: тримати товсту кишку збільшеною, але витягти найвужчу найбільш дистальну частину. Після деяких обстежень на собаках молодий пацієнт був першим пацієнтом, якого вилікували методом Свенсона; він живе і сьогодні і мав чотирьох дітей.
Свенсон пішов далі. Він проаналізував шматочки дистальної кишки, видалені після операції, і відзначив систематичну відсутність кишкових нейронів. Кишкові нейрони становлять внутрішню нервову систему кишечника: у дорослих їх 100 мільйонів, які організовані у дві концентричні нитки, що вистилають травний тракт по всій довжині. Внутрішня сітка регулює хімічну активність травлення, адсорбцію поживних речовин, ферментативні потоки. Більш периферійне кільце затиснуте між двома шарами м’язів: цей м’язово-нейронний агрегат запускає і контролює перистальтичний рух, що дозволяє просувати харчовий болюс. Тому відсутність нейронів у хворій товстій кишці, природно, пояснювала їх перистальтичну недостатність. Але чому пацієнти були позбавлені нейронів саме в цьому місці ?
Нейрони з інших місць
Відповідь веде нас до 1960-х років, в одному з найбільших центрів розведення мишей з біології, лабораторії Джексона, штат Мен, США. Там зберігається понад 7000 генетично ідентифікованих ліній мишей, переважно у вигляді заморожених яєць та сперми. Біолог Прісцилла Лейн цікавився, зокрема, двома лініями, названими смертельними плямистими та кульовими летальними. Чверть мишей у цих лініях померла через кілька днів після народження і представила, як і діти, описані Гіршпрунг, збільшену товсту кишку. Ці лінії явно представляли цінну модель тварини. Крім того, шерсть цих самих молодих мишей була усіяна великими ділянками депігментації, що надало їм характерний плямистий вигляд.
Цей дефект пігментації привернув увагу багатьох дослідників. Було відомо, що клітини, що виробляють пігменти шкіри, меланоцити, походять із тимчасової структури, спільної для всіх хребетних, нервового гребеня. І все ж кількома роками раніше, в 1954 році, Честер Інтема та Уорнер Хеммонд із Державного університету Нью-Йорка в Сіракузах опублікували вичерпне дослідження, в якому описували наслідки абляції різних сегментів нервового гребеня на розвиток курячого ембріона. . Видалення так званого блукаючого сегмента хребта призвело до того, що кишечник ... позбавлений кишкових нейронів! Не зрозумівши зв'язку з хворобою, дослідники зробили курку "Hirschsprung".
Химери на допомогу
Раптом стало зрозуміліше: меланоцити та нервові клітини кишечника походили з тієї самої популяції мігруючих клітин, клітин нервового гребеня. Тому як пігментне, так і кишкове ураження мишей Присцилли Лейн можна пояснити цілком природно, припустивши, що ця клітинна популяція не мігрувала правильно під час ембріогенезу. Концептуальний крок був величезним. Пізніше ця ідея породила загальніше поняття нейрокристопатії, яке включає всі аномалії розвитку та пухлини, що походять від дисфункції клітин нервового гребеня. Хвороба Гіршпрунга - одна з таких, як і синдром Ваарденбурга, який характеризується дефектами пігментації, глухотою та вадами черепа, або хвороба ДіГеорджа, яка призводить до відсутності тимусу та паращитовидної залози, а також вад серця.
Хвороба Гіршспрунга, отже, була обумовлена дефектом міграції клітин від нервового гребеня до кишечника. Але як ці клітини, які походять із первинної ембріональної складки, опинилися в кишечнику тварини, що розвивається? Наприкінці 1960-х Ніколь ле Дуарен, яка тоді працювала в Нантському факультеті наук, запровадила новий і менш інвазивний підхід, ніж абляція. Вона помітила, що клітини перепелів легко відрізнити від клітин курки за допомогою біохімічного фарбування під назвою Фельген. Вона замінила сегменти нервового гребеня курей на шматочки, взяті у перепелів, безпосередньо перед тим, як клітини почали мігрувати, і інкубувала ці перепелино-курячі химери. Потім, аналізуючи їх тканини під час розвитку за допомогою фарбування Фейльгена, вона стежила за долею перепелиних клітин.
Цей метод мав вирішальну перевагу перед ін'єкціями кольорових чорнил, що використовувались до того часу: чорнило розводилося над клітинними відділами, поки воно не стало непомітним, тоді як пересаджені клітини перепелів продовжували чудово ділитися та інтегруватися в цих химерних перепелиних курках. Пляма Фейльгена виявила химерні траєкторії клітин нервового гребеня, як вени від родовища. Вагусні клітини потрапили в травний тракт на рівні майбутнього стравоходу, а потім стікали до товстої кишки (див. Фото на протилежній сторінці), мігруючи всередину стінки кишечника, що розвивається. В людському ембріоні цей вихід клітин починається на четвертому тижні гестації і триває від п’яти до дванадцяти тижнів. Потрапивши на місце, клітини нервового гребеня поступово диференціюються в нейрони, які складатимуть кишкову нервову систему.
У 1970-1980 рр., Завдяки цьому новому розумінню міграції клітин нервового гребеня, різні групи висвітлювали випадок мишей у лабораторії Джексона. Виконуючи трансплантацію кишечника мишам-донорам кишково-кишкового нервового гребеня на товстій кишці миші-господаря, вони показали, що мегаколон смертної лінії п’єтоподібної ґрунти обумовлений міграційним дефіцитом клітин самого нервового гребеня, тоді як плямистих летальних мишей пов’язаний аномалія в тканині хазяїна мігруючих клітин, зародкової кишки. Тоді методи генної інженерії були в самому розпалі: незабаром ми змогли виявити шкідливі генетичні мутації в кожній з ліній, знайти білки, кодовані відповідними генами, і таким чином повернутися до молекулярного механізму міграційного дефекту. Історія виступила проти зерна цього сценарію, який, мабуть, був надто передбачуваним.
У 1988 році японський біохімік Масасі Янагісава та його команда виявили три невеликі білки, що беруть участь у регуляції артеріального тиску, ендотеліни. Щоб діяти, ці білки повинні асоціюватися зі специфічними рецепторами, розташованими на клітинних мембранах. Наприклад, ендотелін 3 або edn3 з високою спорідненістю зв'язується з рецептором EDNRB. Кілька методів лікування артеріальної гіпертензії також засновані на синтетичних молекулах, які чіпляються за ці рецептори. У пошуках молекулярної теорії артеріального тиску японські дослідники видалили у мишей ген, що кодує ендотелін 3. Сюрприз: артеріальний тиск у тварини був нормальним, але збільшена товста кишка та плямиста шерсть! Ненавмисно вони відтворили мишей, які тридцятьма роками раніше заінтригували Прісцилу Лейн у лабораторії Джексона. Точніше, тоді було показано, що у летальних плямистих мишей ген ендотеліну 3 мутував, тоді як у смертельних мишей, що мали смертельну форму, це був ген його рецептора, EDNRB .
Це пояснювало результати експериментів з трансплантації: рецептор, як правило, локалізований на клітинах нервового гребеня, його відсутність у смертельних мишей, що перешкоджали міграції цих мутантних клітин у товсту кишку, яка сама була здоровою; а у летальних плямистих мишей відсутність ліганду edn3, який зазвичай продукується зародковою кишкою, унеможливлює міграцію клітин нервового гребеня через травний тракт.
Кілька років потому група Ніколь Ле Дуарін показала, що ендотелін 3 сильно стимулює проліферацію клітин нервового гребеня і підтримує їх у недиференційованому стані. Тому ми краще зрозуміли стан деяких немовлят із поєднанням хвороби Гіршпрунга та аномалій пігментації шкіри (синдром Ваарденбурга 4 типу): за відсутності ендотеліну 3 клітини їх нервового гребеня передчасно диференціювались у нейрони. Однак останні не мігрують. Тому вони не вторглися в найбільш кінцеву частину травного тракту, товсту кишку. Таким чином, ендотелін 3 виконує дві функції в організмі: він регулює кров'яний тиск у дорослих і затримує диференціювання клітин в ембріоні. Ми називаємо місячним освітленням (“місячним освітленням”) здатність білка виконувати кілька ролей; дослідження можуть у майбутньому виявити єдність, приховану за цими, здавалося б, такими різними функціями.
Однак історія не закінчилася. Генетичні дослідження показали, що гени ендотеліну 3 або його рецептора мутували лише приблизно у 5% випадків Hirschsprung у людей. Отже, ендотелін дійсно був учасником захворювання, але як щодо решти 95%? Відкриття в 1994 році другої родини генів, що беруть участь у хворобі, спрямовувало дослідження на рецептор, який називається RET.
Доріжка хромосоми 10
Група Арнольда Мюнніха в лікарні Некера для хворих дітей у Парижі, а також групи Джузеппе Мартуччіелло з Університету Генуї виявили пацієнта з тотальним агангліонозом кишечника (дуже велика хвороба Гіршпрунга), у якого відсутній фрагмент хромосоми 10. Цей фрагмент, ймовірно, містив ген, необхідний для міграції клітин нервового гребеня в кишечник. Дослідження кореляції послідовності ДНК у сім’ях, що включали декілька осіб із цим захворюванням, дозволили стягнути петлю навколо певної області цієї хромосоми.
Наступного року було показано, що певна кількість пацієнтів носила мутацію гена в цій області, який кодував рецептор RET; ануляція обох копій цього гена у мишей призвела до кишечника, позбавленого нервових гангліїв, а також вад розвитку нирок. Навпаки, надмірна експресія гена призвела до агресивного раку - наприклад, щитовидної залози. Ми знаходимо тут яскравий приклад парадигми, яка впродовж останніх років нав'язала себе науковій спільноті: гени ембріогенезу, спрямовані серед дорослих, призводять до раку.
Яка роль рецептора RET у формуванні кишкової нервової системи? Відповідь не сподівався. Незадовго до цього ми виділили молекулу, звану GDNF, сконцентровану в нирках і кишечнику зародків жаб. Дослідники встановили зв'язок з нирковою та кишковою деформацією, що спостерігається у мишей, у яких відсутня RET. Слідом за цим показником вони показали, що GDNF був його лігандом. Як і пара edn3-EDNRB, рецептор RET експресувався на поверхні клітин нервового гребеня, тоді як його ліганд GDNF концентрувався в тканині перед фронтом міграції. Подібно до того, як мурахи копотяться своїми антенами за слідами феромонів, що ведуть їх до джерела їжі, клітини нервового гребеня йшли шляхом GDNF. Без GDNF або його рецептора RET вони втратили відчуття напрямку і більше не мігрували в кишечник.
Небезпечний марафон
Таким чином, відомі дві основні генетичні причини хвороби Гіршпрунга: мутації, що впливають на пари edn3-EDNRB та GDNF-RET. Вважається, що більшість випадків пов'язані з дисфункцією білка RET. Однак мутації гена RET ідентифікуються лише приблизно в 20-25% випадків. Більшість пацієнтів виробляють менше білка RET, що є наслідком зміни в регуляції експресії генів. Оскільки ці зміни часто зустрічаються серед загальної популяції, цього недостатньо, щоб викликати захворювання, але є схильним фактором, до якого додаються інші генетичні фактори, що впливають на один або кілька генів, що беруть участь у розвитку кишкової нервової системи.
Сьогодні, незважаючи на ці значні досягнення та відкриття інших задіяних генів, ми знаємо, як встановити взаємозв'язок між генотипом та хворобою приблизно в 50% випадків. Ймовірно, що гени, які можуть втрутитися, численні та різноманітні. Кілька команд, таких як Станісласа Ліоне та Жанни Аміель, з інституту Imagine у Парижі, або Сільві Дюфур з біомедичного дослідницького інституту Мондора в Кретей, продовжують характеризувати їх.
Насправді, інтуїтивно зрозуміло, що причини агангліонозу товстої кишки різні: щоб колонізувати весь травний тракт, клітини нервового гребеня повинні пробігти марафон під час поділу. Ця подорож не тільки довга, але і приурочена: кишечник подовжується в геометричній прогресії під час ембріонального розвитку і досягає майже 3 метрів у новонародженої дитини. Запізнілі клітини мігрантів ризикують не перетнути фінішну пряму. У моїй лабораторії ми також показали, що еластичність тканини впливає на міграцію: в той час як клітини нервового гребеня спочатку мігрують через дуже поступливий клітинний збір, ця посилюється в консистенції з години на годину. колаген, який структурує тканину. Ці волокна та м’язи, що поступово диференціюються, ускладнюють міграцію. Таким чином, мутації в генах, що кодують колаген, або в ферментах, що його розщеплюють, є потенційними кандидатами для певних невирішених випадків захворювання та інших нейрокристопатій.
В даний час ідентифікація генів, що беруть участь у хворобі Гіршпрунга, дає змогу визначити, чи передається пов'язана мутація з плодом, і дати ймовірність появи у дитини. Однак ми не знаємо, як виявити дефект міграції клітин під час вагітності. Крім того, через змінну виразність задіяних генів, ми не знаємо, як запобігти найбільш серйозним формам, таким як тотальний агангліоз, для яких немає хірургічного рішення.
З терапевтичної точки зору досліджується ін’єкція стовбурових клітин нервового гребеня для виправлення дефектів іннервації у новонароджених. Нещодавно дослідники показали, що, пересадившись в товсту кишку летальних плямистих мишей, стовбурові клітини нервового гребеня мігрують і диференціюються в нейрони; всі пересаджені миші вижили. Однак перед переходом на людину існує ще багато труднощів: яке джерело стовбурових клітин? Як їх вводити та оцінювати, за межами рівня виживання, відновлення функції травлення? На даний момент хірургічне втручання залишається найкращим рішенням: вдосконалення процедури Свенсона дозволяють краще зберегти іннервацію прямої кишки та сечового міхура і в 95% випадків призводять до лікування; рівень післяопераційних ускладнень становить від 5 до 15%.
Часто кажуть, що дослідження двадцять першого століття будуть роботою спеціалізованих груп, організованих у багатонаціональних консорціумах. Чи все-таки є місце романтичному баченню самотнього вченого, який дає волю своїм спостереженням та умозаключенням? Наукова література, якою ділиться всі, є ключовим фактором, який дав величезний прогрес у нашому розумінні хвороби Гіршпрунга. Але ці спалахи також несуть на собі, і навіть передусім, ознаку особливого та упертого погляду людей: Харальда Гіршпрунга, який поставив перший діагноз хвороби, Орвара Свенсона, який натомість покладався на свій здоровий глузд. того часу, Ніколь Ле Дуарен, яка розгорнула весь потенціал простого спостереження над ядром перепелиних клітин ... Як бачимо, романтизм вченого, який не обмежується ізоляцією, актуальний як ніколи.