Терапевтична доставка генів та трансфекція в клітинах раку підшлункової залози людини з використанням епідермального росту
Резюме
Інженерна нановекторна система типу B на основі желатину (SREG) була розроблена для системної доставки та трансфекції генів при лікуванні раку підшлункової залози. Модифікуючи специфічний для пептиду епідермальний фактор росту (EGFR) пептид на поверхні наночастинок, вони можуть націлюватися на рецептор EGFR і вивільняти плазміду в умовах зменшення довкілля, таких як високі концентрації внутрішньоклітинного глутатіону.
Анотація
Більше 32 000 пацієнтів діагностують рак підшлункової залози в США щороку, і хвороба асоціюється з дуже високою смертністю 1. Існує нагальна потреба у розробці нових клінічно перекладних терапевтичних стратегій, які можуть покращити похмуру статистику виживання пацієнтів з раком підшлункової залози. Хоча генна терапія раку показала величезні перспективи, головна проблема полягає у розробці безпечної та ефективної системи доставки, яка може призвести до стійкої експресії трансгену.
Більшість протипухлинних генних терапій зосереджуються на введенні генів супресорів пухлини, таких як p53 дикого типу (WT-p53), для відновлення проапоптотичної функції в клітинах 9. Механізм p53 працює як важливе сигнальне середовище для росту клітин, яке регулює апоптоз, зупинку клітинного циклу, метаболізм та інші 10 процесів. При раку підшлункової залози більшість клітин мають мутації білка p53, що спричинює втрату апоптотичної активності. З введенням ваги-p53 апоптоз можна було б відновити і спричинити загибель клітин в інших 11 ракових клітинах.
На основі вищезазначених міркувань ми розробили модифіковані пептидом EGFR тіольовані наночастинки желатину для доставки гена p53 та вагової ефективності оціненої доставки та трансфекції клітин Panc-1.
Протокол
1. Приготування наночастинок желатину, інкапсульованих у плазмідну ДНК EGFR
2. Характеристика цільових наночастинок EGFR
3. У дослідженнях трансфекції in vitro з клітинами раку підшлункової залози Panc-1
4. Репрезентативні результати
1. Синтез та характеристика цільових наночастинок EGFR
Наночастинки пептиду, модифіковані EGFR, були синтезовані за схемою, зображеною на малюнку 1. Наночастинки, приготовані методом десольвації, характеризували розмір частинок та дзета-потенціал. Середній розмір заряду та площа частинок, приготованих з тіольованих желатинів з різним ступенем тіоляції, наведені в таблиці 1. Середній діаметр частинок різних наночастинок становив від 150 до 250 нм. Тіольовані наночастинки мають менший розмір порівняно з наночастинками желатину, можливо, через утворення дисульфідних містків всередині частинок. З різними модифікаціями поверхні розміри наночастинок збільшувались. Дзета-потенціали різних композицій становили близько -20 мВ. За допомогою SEM-аналізу спостерігали розмір, морфологію поверхні та сферичну форму наночастинок, що відповідало суміші Zetasizer. Ефективність завантаження ДНК у наночастинках желатину та наночастинках желатинового тіолу перевищувала 95% (Таблиця 1).
Характеристика наночастинок
| Формулювання | Діаметр наночастинок (нм) | Дзета-потенціал (мВ) | Ефективність завантаження плазмідної ДНК (%) |
| NP гель | 151,4 ± 23,5 | -17,1 ± 5,23 | 95,6 ± 2,2 |
| SH-Gel NP | 132,6 ± 17,9 | -24,6 ± 5,16 | 97,0 ± 3,8 |
| SH-гель-ПЕГ | 179,0 ± 30,9 | -22,3 ± 9,50 | 95,8 ± 6,5 |
| SH-гель ПЕГ-пептид | 230,8 ± 41,5 | -18,1 ± 4,02 | 94,8 ± 5,1 |
Вашbles 1. розмір частинок, поверхневий заряд та ефективність контролю інкапсуляції плазмідної ДНК та цільові наночастинки желатину та желатинового тіолу.
Сканування електронної спектроскопії з високою роздільною здатністю для хімічного аналізу (ESCA) використовували для аналізу поверхневих компонентів тіольованого желатину (SH-Gel NP), модифікованого ПЕГ тіольованого желатину (SH-Gel PEG) та EGFR-пептиду модифікованого тіолом желатину наночастинок (SH-гель ПЕГ-пептид). Результати в таблиці 2 показують пікові інтенсивності СН (вуглеводнів), CO (ефіру) та C = O (карбонільних) груп при 285,0, 286,3, 288,1 та еВ відповідно. Сигнал ефірного СО збільшувався після модифікації, а ПЕГ зменшувався після кон'югації пептидів. У той час як склад азоту зменшувався після модифікації, а ПЕГ збільшувався після модифікації пептидів, що підтверджувало наявність пептиду, націленого на EGFR, на наночастинках. Аналіз ESCA додатково підтвердив модифікацію поверхні ПЕГ та пептиду.
Електронна спектроскопія для хімічного аналізу поверхні наночастинок композиції
| Формулювання | C 1s (%) | O 1s (%) | N 1s (%) |
| SH-Gel NP | 59,3 ± 0,8 | 22,9 ± 0,5 | 12,9 ± 0,1 |
| SH-гель-ПЕГ | 58,2 ± 0,6 | 28,0 ± 1,2 | 9,5 ± 0,7 |
| SH-гель ПЕГ-пептид | 56,7 ± 0,8 | 25,9 ± 0,7 | 12,3 ± 0,6 |
| Формулювання | CC (%) | CO, N (%) | C = O (%) |
| SH-Gel NP | 51,5 | 26.6 | 21.9 |
| SH-гель-ПЕГ | 17.1 | 63.1 | 19.8 |
| SH-гель ПЕГ-пептид | 33.1 | 42,8 | 24.1 |
Таблиця 2. C 1S сканування електронної спектроскопії з високою роздільною здатністю для хімічного аналізу (ESCA)
Для того, щоб вивчити стабільність інкапсульованої плазміди, наночастинки обробляли протеазою або ДНКазою окремо, одночасно або послідовно. Після електрофорезу результати на малюнку 2 показали, що плазмідна ДНК, інкапсульована у всіх наночастинках, захищена наночастинками та стабільною, оголеною плазмідною ДНК, порівнянною з. Ці дослідження показали, що всі ці наночастинки можуть інкапсулювати та зберігати структуру плазміди після інкапсуляції.
/ Files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg "/>Малюнок 2. Стабільність тіол-інкапсульованої плазмідної ДНК в желатині, ПЕГ-модифікованому тіольованому желатині та EGFR-модифікованому тиолом пептиді, модифікованому желатином наночастинках за допомогою гель-електрофорезу. Наночастинки обробляли 0,2 мг/мл протеази, щоб довести інкапсуляцію плазмідної ДНК в матриці наночастинок
2. Експресія основи EGFR у клітинах раку підшлункової залози
Дві лінії аденокарциноми клітин підшлункової залози (Panc-1 та Capan-1) аналізували за допомогою вестерн-блот для експресії EGFR. Аденокарцинома яєчників людини (SKOV3) та мишачі фібробласти ((NIH-3T3), клітини були обрані як позитивні та негативні контролі, відповідно. Бета-актин аналізували як контроль завантаження білка. Клітини Panc-1 демонстрували вищу експресію EGFR порівняно з 1, і цю клітинну лінію потім використовували для наступних досліджень in vitro
3. Контроль цитотоксичності та наночастинок тіольованого желатину SurfaCE на добу
Для оцінки клітинної взаємодії наночастинок після обробки наночастинками проводили тести на цитотоксичність. За результатами малюнку 3 контрольні та поверхнево модифіковані наночастинки були відносно безпечними та біосумісними у клітинах Panc-1, навіть у високих концентраціях, порівняно з островом. Наступні дослідження проводили з наночастинками 1 мг/мл.
Малюнок 3. Життєздатність клітин Відсоток на основі концентрацій наночастинок у клітинах Panc-1, оцінених за допомогою аналізу тетразолієвого барвника (MTS)
4. Опосередковане рецептором клітинне поглинання в клітинах Panc-1
Для підтвердження поверхневої доступності пептидів, націлених на EGFR, та поглинання наночастинок ендоцитозом, опосередкованого рецепторами, була розроблена система, позначаючи кожен компонент різною флуоресценцією для візуалізації поглинання наночастинок та торгівлі клітинами. За допомогою цієї системи мічення плазмідну ДНК, наночастинки та ядро клітини не вдалося ідентифікувати. Конфокальну флуоресцентну лазерну скануючу мікроскопію застосовували для зйомки зображень у різний час - від 15 хвилин до 6 годин. Порівнюючи зображення різних композицій, кон'юговані пептидом наночастинки желатину продемонстрували швидке поглинання та вивільнення плазміди протягом 30 хвилин. Цей результат додатково довів, що кон'юговані з EGFR пептидом наночастинки зазнали ендоцитозу, що сприяло швидкій взаємодії між EGFR-специфічним пептидом та рецепторами EGFR на клітинній поверхні, що було набагато швидше, порівняно з іншими наночастинками, які зазнали неспецифічного ендоцитозу.
Дослідження стільникового трафіку
Малюнок 4. Конфокальний флуоресцентний мікроскопічний аналіз інкапсульованого поглинання ДНК наночастинок та незаконного обігу Panc-1 з клітин. (Червоний = мічені родамином наночастинки, зелений = мічена PicoGreen плазмідна ДНК, а синій = DAPI-мічене ядро). Потужність лазера була в 7 разів менше, ніж останні чотири цифри нижньої панелі.
5. Якісна та кількісна трансфекція in vitro за допомогою посиленого зеленого флуоресцентного білка
ELISA на малюнку 5 та флуоресцентний мікроскопічний аналіз на рисунку 6 використовувались для вимірювання якісної та кількісної ефективності трансфекції GFP у клітинах Panc-1 при введенні немодифікованих, модифікованих PEG-пептидів та модифікованих EGFR-тіолом желатинових наночастинок. Плазміди, отримані наночастинками, націленими на EGFR, призвели до найвищого рівня експресії GFP через 48 годин порівняно з іншими контролями, включаючи ДНК-комплексний ліпофектин.
Малюнок 5. Експресія GFP, проаналізована за допомогою ІФА, нанесена на графік щодо часу після введення плазмідної ДНК в контролі та наночастинках, націлених на EGFR.
Флуоресцентний мікроскопічний аналіз для трансфекції GFP
Малюнок 6. Якісний аналіз експресії зеленого флуоресцентного білка Panc-1 клітин методом епіфлуоресцентної мікроскопії через 24, 48, 72 та 96 годин після трансфекції EGFP-N1. Комплекс ДНК ліпофектину використовували як позитивний контроль.
6. Трансфекція in vitro плазмідою р53 дикого типу в клітинах Panc-1
Плазміди p53 pORF-hp53 дикого типу з об'єктивним гібридним промотором EF-1α/HTLV витягували з E. coli та інкапсулювали в наночастинки для вивчення терапевтичного апоптотичного ефекту. Клітини Panc-1 обробляли частинками протягом 6 годин і після трансфекції протягом додаткових 24, 48, 72 та 96 годин.
Оскільки p53 може індукувати апоптоз у клітинах і для виконання цієї функції, багато факторів транскрипції нижче за течією будуть задіяні і безпосередньо регулюються експресією WT-p53. Серед них Bax, каспаза-3, каспаза-9, DR5, PUMA та Apaf-1 регулювались би експресією р53, а тоді як Bcl-2, сурвівін був би знижений. Для вивчення рівнів цих факторів транскрипції мРНК екстрагували з клітин Panc-1 через 48 годин після трансфекції та використовували для RT-PCR. Продукти оцінювали за допомогою гель-електрофорезу, а смуги аналізували за допомогою ImageJ. На підставі результатів, показаних на малюнку 7, сурвівін суттєво зменшився при наведенні тиольованих желатинових наночастинок EGFR у порівнянні з іншими методами лікування, не спостерігалося явних змін у Bcl-2, Bax та експресії каспази-3, каспази-9, DR5, PUMA і Apaf-1 збільшувався при обробці цільових наночастинок.
les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg "/>Малюнок 7. Рівні мРНК фактора ваги р53 нижче за течією порівнювали для експресії за допомогою RT-PCR через 48 годин після трансфекції.
Після трансфекції вагою p53 для конденсації хроматину/проникності мембран/апоптозу мертвих клітин використовували диференціювати апоптотичні клітини, некротичні клітини та живі клітини з різними барвниками. Дослідницький візуалізаційний цитометр CompuCyte (Westwood, MA) був використаний для аналізу та порівняння рівнів апоптозу після лікування. Порівняно з негативним контролем, апоптотичні зміни клітин були розраховані на складки і перераховані на малюнку 8. Нанопатики тіолового желатину, орієнтовані на EGFR, показали найвищу популяцію апоптотичних клітин після посттрансфекції. Аналіз активності каспази 3/7 також показав, що наночастинки, спрямовані на EGFR, мають швидку інтерналізацію та найвищий рівень апоптотичної активності в клітинах Panc-1.
Малюнок 8. Цитометричний аналіз проапоптотичної активності в контрольованих вагою p53 трансфікованих клітинах Panc-1 за допомогою iCys ° Imaging Cytometer
Обговорення
Наночастинки тіолового желатину, контрольовані за допомогою EGFR, отримували з ефективною інкапсуляцією ДНК та стабільністю. Розміри частинок усіх цих систем були в діапазоні 150-250 нм в діаметрі. Потенційна Зета довела, що ця система є дещо негативною. При SEM-аналізі розміри наночастинок були однаковими з результатом Zetasizer. Аналіз ESCA може підтвердити модифікацію поверхні ПЕГ та пептиду.
Вестерн-блот-аналіз показав, що клітини Panc-1 мали високий рівень експресії EGFR, і ця клітинна лінія була використана для досліджень in vitro. Як контрольні, так і поверхнево модифіковані наночастинки були відносно менш цитотоксичними в клітинах Panc-1 порівняно з PEI.
Дослідження торгівлі клітинами показали швидке поглинання та вивільнення наночастинок, орієнтованих на плазміду EGFR, у клітини Panc-1. Доставка плазмід ДНК-експресуючих EGFR-репортерів, націлених на наночастинки, призвела до вищих рівнів експресії GFP порівняно з іншими контролями, включаючи ДНК-комплексований ліпофектин. З тією ж системою трансфекція плазмідою WT-p53 викликала подальший апоптотичний шлях і швидко індукувала апоптоз клітин Panc-1.
Ці попередні результати дозволяють припустити, що орієнтовані на EGFR тіольовані наночастинки желатину можуть служити безпечною та ефективною системою доставки ДНК для генної терапії як лікування раку підшлункової залози.
Розкриття інформації
Відсутність заявлених конфліктів інтересів.
Подяка
Це дослідження було підтримане грантом Національного інституту раку з нанотехнологій для Центру раку з нанотехнологій та досконалості раку (CCNE) U54 CA151881-.