Терапевтичний пропуск екзону при дисферлінопатіях Європейський журнал генетики людини

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Методи
  • База даних
  • AON
  • Культура клітин та трансфекція
  • РНК-аналіз
  • Результати і обговорення
  • Екзонні стрибки для дисферліну
  • Визначте пріоритети екзонів DYSF
  • Доцільність пропуску екзону DYSF
  • Заключні зауваження

Теми

  • Альтернативне зрощення
  • Антисмислові елементи
  • Нервово-м’язові захворювання
  • Виправлення до цієї статті було опубліковано 19 серпня 2010 року

Анотація

вступ

М'язова дистрофія пояса кінцівок типу 2B (LGMD2B), міопатія Міоші (MM) та дистальна міопатія з переднім відділом великогомілкової кістки (DMAT) - захворювання аутосомно-рецесивного алельного м'яза, спричинені мутаціями гена DYSF, що кодує дисферлін, що призводить до важкої або повної відсутності білок дисферлін. 1, 2, 3 У більшості пацієнтів спостерігаються невеликі мутації: мутації зупинки або зсуву кадрів призводять до передчасно зрізаних білків, тоді як мутації помилок зазвичай впливають на стабільність білка. 4 Понад 100 різних мутацій зареєстровано у Лейденській базі даних відкритих варіацій майже на 200 пацієнтів (www.dmd.nl). Оскільки в даний час не існує лікування "дисферлінопатій", відсутність дисферліну призводить до поступової втрати тканини та функції м'язів кінцівок та пояса. 5

дисферлінопатіях

Білок дисферліну експресується у багатьох тканинах, але переважно в серці та скелетних м’язах. В останньому випадку білок знаходиться на рівні плазматичної мембрани та в цитоплазматичних пухирцях. 6 Вважається, що дисферлін відіграє роль у везикулярному обігу та відновленні злиття мембранних пластирів у м’язових клітинах. 5 Втрата дисферліну ставить під загрозу відновлення мембрани скелетних м’язів і призводить до поступової втрати м’язових волокон. 6 Білок має різні домени (рис. 1). База даних ENSEMBL передбачає шість-сім залежних від кальцію доменів зв'язування ліпідів С2, один трансмембранний домен та множинні "залізні" та "дисфункційні" домени. Домени С2, ймовірно, опосередковують залежність від кальцію злиття везикул із плазматичною мембраною, тоді як трансмембранні домени закріплюють білок у плазматичній мембрані. 5 Доміни заліза та дисфункції все ще виконують невідому функцію. 4

Домени дисферліну проти екзонів DYSF. Дисферлін містить шість або сім залежних від кальцію доменів зв’язування ліпідів C2 (C2), трансмембранний домен (T), домен ферлу (L), домени FerA та FerB (A та B відповідно) та домени Dysf_N та Dysf_C (N та C відповідно). С2 і трансмембранні домени виконують функцію відновлення мембрани. Функція інших доменів досі невідома.

Повнорозмірне зображення

Таким чином, можливо, що обхід мутацій дисферліну призведе до більш (частково) функціональних білків дисферліну і, отже, має терапевтичний потенціал. Одним із способів досягти цього є модуляція сплайсингу попередніх РНК дисферлінів за допомогою антисмислових олігонуклеотидів (AON) або антисмислових послідовностей, які маскують цільові екзони сплайсингу, щоб вони не були включені в остаточну мРНК (“пропуск екзону” ) (Малюнок 2). Початковий доказ концепції нещодавно був показаний у контрольних та похідних від пацієнта клітинах, де пропуск екзону 32 був викликаний AONs або модифікованим U7 snRNP, в якому вихідна антисмислова послідовність була замінена цільовою антисмисловою послідовністю. 9

Пропустити екзон, викликаний антисмислом. Ліва панель: у цьому прикладі мутація екзону 32 призводить до передчасного стоп-кодону (на це вказує зміна від чорного до білого в пре-мРНК (зверху) та мРНК (посередині), що призводить до передчасно усіченого білка (внизу) Права панель: Коли використовуються антисмислові олігонуклеотиди (AON), націлені на екзон 32, вони гібридизуються з цим екзоном, маскуючи його таким чином від механізму сплайсингу, який змушує цей екзон пропускати. Як екзон 32 у кадрі (його довжина ділиться на три), пропуск не порушить рамку зчитування (мРНК почорніє на середній панелі) і може генеруватися повний білок, який трохи відсутній в середині (внизу).

Повнорозмірне зображення

Насправді, підхід пропуску екзону в даний час є найбільш перспективним терапевтичним підходом до м’язової дистрофії Дюшенна (ДМД). Це захворювання викликане повною втратою функціонального дистрофіну внаслідок мутацій, які порушують відкриту рамку зчитування гена DMD. Як і дисферлін, дистрофін містить як основні, так і менш важливі домени, що підкреслюється тим фактом, що пацієнти з мутаціями в центральному резервному домені мають менш важкий стан, який називається м’язовою дистрофією Беккера. 12, 13, 14 Медикаментозний екзон, що пропускає AON у пацієнтів з ДМД, має на меті відновити відкриту рамку зчитування, дозволити продукувати частково функціональний білок та перетворити важкий ДМД на більш м’який фенотип МПК. Цей підхід був розроблений в нашій лабораторії та колегами з Японії, Австралії та Великобританії 10, 15, 16, 17, 18 і зараз перебуває на етапі I/II клінічних випробувань. 19, 20

У цьому дослідженні ми проаналізуємо, які екзони DYSF можуть бути придатними мішенями для антисенсорного опосередкування пропуску екзонів, а які менш або непридатні, залежно від доменів, що кодують білок, та мутацій, про які повідомляється. Ми також показуємо, що використання наших рекомендацій, встановлених після ретроспективного аналізу нашого набору AON DMD, дозволяє легко ідентифікувати AON, що викликають пропуск екзону DYSF .

Методи

База даних

Проаналізовано мутації, зареєстровані 8 травня 2009 року в базі даних DYSF LOVD (www.dmd.nl).

Дизайн AON базувався на наших рекомендаціях щодо екзонів DMD і мав на меті орієнтуватись на частково відкриті вторинні структури РНК (передбачається m-кратним числом 21), наявність передбачуваних RESCUE-ESE та SC35 та відсутність передбачуваних сайтів Tra2 β (з використанням сплайсинг людини). шукач 22) і сприятлива енергія зв'язку. 21, 23 Усі AON (табл. 1) націлені на внутрішні послідовності екзонів і складаються з 2′-O-метилової РНК із фосфоротіоатною основою на всю довжину та були виготовлені Eurogentec (Seraing, Бельгія).

Повний розмір таблиці

Культура клітин та трансфекція

Міобласти контролю людини вирощували та диференціювали, як описано вище. 24 AON трансфікували в концентрації 500 нМ, використовуючи 2,5 мкл поліетиленіміну (MBI-Fermentas, Leon-Rot, Німеччина) на мкг AON, відповідно до інструкцій виробника. Екзон, націлений на AON 45 неспорідненого 5-флуоресцеїнового гена дистрофіну, був використаний для підтвердження ефективності трансфекції (> 90%).

РНК-аналіз

РНК виділяли через 28 годин після трансфекції за допомогою РНК-бджіл (Campro Scientific, Veenendaal, Нідерланди) згідно з інструкціями виробника. RT-PCR проводили із випадковими гексамерними праймерами, як описано. Праймери, фланкуючі цільові екзони (послідовність на вимогу), використовувались для ампліфікації кДНК, як описано раніше для дистрофіну 24, але з використанням однієї ПЛР протягом 35 циклів. Пропущені продукти аналізували шляхом аналізу секвенування, як описано. 24

Результати і обговорення

Екзонні стрибки для дисферліну

Очевидно, що не всі екзони DYSF можна ігнорувати без наслідків для функції дисферліну. По-перше, якщо пропущений екзон виходить за рамки (тобто довжина не ділиться на три), це призведе до порушення відкритої рамки зчитування та передчасно усіченого білка. Таким чином, або вбудовані екзони, або комбінація позакадрових екзонів, які утримують кадр зчитування разом, є допустимими цілями (Рисунок 3 і Таблиця 2).

Екзони дисферліну. Екзони на зображенні показані білим кольором, а незображені екзони - чорним кольором. Екзони або комбінації екзонів можна ігнорувати, не порушуючи кадр зчитування, коли отримані кінці налаштовані (наприклад, екзони 39 і 40 можна ігнорувати, оскільки кінець екзона 38 відповідає початку екзона 41).

Повнорозмірне зображення

Повний розмір таблиці

По-третє, ігнорувати можна лише внутрішні екзони. Екзони 1 і 55 тому недійсні цілі. Інші екзони, які забезпечують недійсні мішені, - це рамкові екзони 19, 25 та 49, для яких у пацієнтів LGMD2B та MM були виявлені мутації місця сплайсингу, що призводять до пропуску екзонів (підтверджено RT-PCR) (4 та база даних LOVD DYSF). Мутації, які можуть вплинути на сплайсинг (розташовані в місцях зрощення або поблизу них), були виявлені у пацієнтів з MM та LGMD2B для екзонів 24, 30, 32, 34, 37 та 41. Однак мутації були знайдені на рівні ДНК і не були підтверджені в рівень РНК.

На основі цієї інформації екзони можна розділити на придатних, менш придатних та неможливих кандидатів (табл. 2). Хоча в гені DYSF немає гарячих точок мутації, деякі екзони містять більше мутацій, ніж інші, і тому пропуск цих екзонів буде застосовним до більших груп пацієнтів (див. Таблицю 2). Зокрема, на сьогоднішній день не повідомляється про мутації для екзонів 17 і 35.

Визначте пріоритети екзонів DYSF

Очевидно, оцінюючи доцільність пропуску екзонів DYSF, слід починати з найпростішого підходу (пропускання одного екзону), націлюючи найбільш імовірні або підтверджені екзони як зайві. Це включає екзони 17, 32, 35, 36 і 42. Оскільки досі не повідомляється про мутації для екзонів 17 і 35, доцільно не зосереджуватись на цих екзонах. Екзони 34 і 41 є вбудованими цілями і теоретично прийнятні, оскільки вони не кодують жодного домену або надлишкового домену С2. Однак передбачувані причинно-наслідкові мутації, що викликають пропуск цих екзонів, були виявлені на рівні ДНК. Таким чином, екзони 32 і 36, здається, є першими кандидатами, інші згадані екзони наближаються до другого.

Оскільки можна одночасно пропустити два або три екзони (подвійний та потрійний пропуск відповідно) для DMD 25, 28, але, ймовірно, також і для DYSF. Єдина комбінація суміжних екзонів, які знаходяться разом у кадрі (тобто загальна кількість нуклеотидів ділиться на три), хоча жоден домен не кодується, становить 20 + 21, тоді як деякі комбінації екзонів у кадрі також можливі (18+ 19 + 20 і 31 + 32 + 33).

Нарешті, екзони 24 і 30 у кадрі кодують домени FerB та Dysf-C2, додаткові домени, для яких сутність функції дисферліну досі невідома. Таким чином, пропуск екзону для цих екзонів може бути корисним. Усі інші екзони або комбінації екзонів кодують домени С2 або трансмембранний домен і дуже ймовірно впливають на функцію білка. Тому вони повинні мати нижчий пріоритет (Таблиця 2).

Доцільність пропуску екзону DYSF

Антисмислове пропускання екзонів DMD дуже просто; Визначено AON для пропуску кожного екзона. 23, 29, 30 Щоб оцінити, чи можна пропустити екзон так просто для екзонів DYSF, ми розробили два AON для кожного екзона, орієнтованих на екзони 19, 24, 30 і 34 DYSF, і один AON, націлений на малий екзон 32, використовуючи наш попередній метод. визначив керівні принципи проектування AON. 23, 29 AON трансфікували в диференційовані контрольні міобласти людини. Аналіз RT-PCR показав, що шість AON були ефективними та спричинили пропуск екзонів 19, 24, 30 та 34 (рис. 4). Рівень пропуску екзону коливався від 17% (екзон 34) до 96% (екзон 30). Зокрема, спонтанні стрибки (альтернативне зрощування) екзону 30 спостерігались у необроблених клітинах з низькою концентрацією (10%). Поодинокий екзон 32 AON не був ефективним (рис. 4), але пропуск екзону 32 може бути викликаний іншими AON. 9

RT-PCR аналіз контрольних культур клітин, оброблених AON. 19–2, 24–1, 24–2, 30–1, 30–2 і 34–1 ефективні, тоді як 19–1, 32, 34–2 та С (контрольна АОН, спрямована на ДМД (дистрофін)) ні. Правильний пропуск екзону підтверджено аналізом послідовностей (дані не наведені). Жодного стрибка екзону 19, 24, 32 чи 34 не спостерігалося у необроблених клітинах (NT), тоді як для екзону спостерігався низький рівень фізіологічного стрибка. Лікування АОН значно збільшило ці рівні на 90%. Відсотки хмелю за допомогою Lab-on-a-chip (Agilent, Амстелвен, Нідерланди) показані під кожним стрибком. Зверніть увагу, що інтенсивність продуктів стрибка нижча через зменшену довжину фрагментів (наша оцінка ефективності це виправляє). –RT та H 2 O є негативними контролями. М - маркер розміру.

Повнорозмірне зображення

Для деяких екзонів DMD спостерігали пропуск додаткових сусідніх екзонів або виключно, або на додаток до пропуску лише цільового екзона. 29 Це небажано для дисферлінопатій, оскільки пропуск ряду екзонів у кадрі призводить до нефункціональних дисферліній (табл. 2). Однак пропуску додаткових екзонів не спостерігалося для чотирьох екзонів дисферліну, націлених у цьому дослідженні (дані не наведені). Крім того, пропуск декількох екзонів трапляється лише зрідка для екзонів DMD, і навіть коли це трапляється, кількість розшифровок за один пропуск часто набагато перевищує кількість розшифровок, в яких послідовно пропускаються кілька екзонів.

Заключні зауваження

На закінчення, пропуск екзону створює передбачувану стратегію для дисферлінопатій, хоча деякі екзони, можливо, є більш прийнятними, ніж інші. Слід підкреслити, що ідеальними цільовими мутаціями є гомозиготні мутації в придатному цільовому екзоні, оскільки в цьому випадку ігнорування цільових екзонів на обох алелях може бути терапевтичним. Однак, оскільки 10% рівнів дисферліну здається достатнім для поліпшення фенотипу 7, цей підхід також обіцяє гетерозиготні мутації. Ігнорування лише мутованого екзону тут може бути потенційно терапевтичним, тоді як ігнорування нецільового алелю - ні. Тим не менше, це все одно може призвести до рівня дисферліну до 50%. На щастя, пропускати екзони DYSF здається простим. Відомо, що певні мутації можуть спричинити неправильне згортання та утримання дисферліну в ендоплазматичній сітці. Це також є можливість для внутрішньо пригнічених дисферлінів. Тому необхідні дослідження на клітинах, орієнтованих на пацієнта, оскільки лише вони зможуть підтвердити, чи інші внутрішньо пригнічені дисферліни функціонують та правильно локалізовані.