Виділення та диференціація одержуваних з жиру стовбурових клітин із свинячої підшкірної жирової клітини

Вступ

Ожиріння, на частку якого припадає приблизно 30% населення США, з індексом маси тіла понад 30, стало світовим явищем 1. Ожиріння 2-4, як правило, призводить до ускладнень, пов'язаних із серцево-судинними захворюваннями, діабетом 2 типу та раком. Тому з ожирінням можна боротися - це важливий пріоритет. Ожиріння проявляється масовим розширенням жирової тканини, і це пояснюється переїданням та малорухливим способом життя в сучасному суспільстві. Таким чином, проведення транскрипційної регуляції адипогенезу та розшифровки ліпогенезу може обіцяти лікування ожиріння або діабету.

3T3-L1, 3T3-F442A та інші адипогенні клітинні лінії миші були застосовані для вивчення адипогенезу або ліпогенезу під час розвитку жирової тканини. Однак існують певні відхилення в механізмах регуляції між клітинними лініями in vitro та in vivo тварини 6. Первинні жирові тканини, отримані із стовбурових клітин (ADSC) у фракції судинних клітин строми, можуть бути виділені безпосередньо з білої жирової тканини та спонукані диференціюватись. Диференціація ADSC в адипоцитах, швидше за все, рекапітулює процес адипогенезу та ліпогенезу в розвитку жирової тканини in vivo 7.

Свині є відповідною твариною моделлю для вивчення адипогенезу та ліпогенезу у розвитку жирової тканини. Наші попередні дослідження свиней 8-10 показують, що експресія стеролу - регуляторного елемента, що зв’язує фактор транскрипції 1c (SREBP1c), важливий фактор транскрипції, який, як відомо, модулює транскрипцію ліпогенної синтази жирних кислот, яка інгібується поліненасиченими жирними кислотами (ПНЖК) у печінці свині та жировій тканині . Експресія свинячого SREBP1c знижується на PUFA in vivo та in vitro, аналогічно іншим видам, таким як людина та миша 11-13. Ці дослідження свиней in vitro проводяться головним чином у диференційованих адипоцитах, отриманих із свинячого ADSC (pADSC). Отже, цю первинну культуру клітин pADSC можна використовувати як надійну клітинну систему для розвитку жирової тканини або для вивчення інших застосувань стовбурових клітин.

Протокол

ПРИМІТКА: Цей метод був виготовлений та використаний у дослідженнях, про які раніше повідомлялося в лабораторії 14-17; з часом методологія змінювалася. Поточну процедуру проводили у поросят (віком від 7 до 9 днів) з посівом на 6-лункові пластини для культури тканин із середньою жировою тканиною свинячої підшкірної тканини 60 г. Всі процедури проводились на RT, якщо не вказано інше. Усі експерименти на тваринах були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (IACUC) при Національному тайванському університеті.

1. Приготуйте травне середовище

1. Отримати підшкірний жир з шиї та спини; Від 40 до 80 г на порося (віком від 7 до 9 днів), залежно від розміру свиней. Тут використовують 60 г підшкірної жирової тканини, отриманої від свині.
2. Приготуйте середовище для травлення: зважте порошок колагенази II загалом 54000 одиниць і розчиніть його у 90 мл модифікованого Дульбекко середовища Eagle (DMEM, 60 г жиру) у серологічній пляшці об’ємом 100 мл (900 одиниць колагенази/1,5 мл DMEM/г жиру ).
3. Акуратно закручували для стерилізації, щоб розчинитись щонайменше 15 хвилин, а потім пропустити середовище для травлення через фільтр 0,22 мкм, щоб пропустити середовище для травлення на струшувальному столі (100 об/хв). Зберігати при температурі 4 ° C перед використанням.

2. Розсічіть підшкірну жирову тканину від свині

Рисунок 1. Індивідуальний різальний верстат для Виділення використовуваного pADSC. Розсічена жирова тканина з підшкірної жирової тканини свинячої корейки, що складається з жирового шару з прикріпленими шарами шкіри. Різальна машина потрібна для розрізання жирового шару товщиною близько 1 мм, щоб уникнути надрізу в шари шкіри. Зліва направо: тримач шайби, нарізка нарізки, ріжуче лезо з вуглецевої сталі та гвинти. Ножик для нарізки вставляється між тримачем зрізів та накладкою для нарізки, коли він зібраний. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

3. Збір pADSC із стромо-судинної фракції

1. Проведіть середовище для травлення, що містить перетравлену жирову тканину, через один шар шифону в чистій стерилізованій колбі Ерленмейера на 250 мл або серологічній колбі на 250 мл. За допомогою пари плоскогубців натисніть на центр шифону, щоб вести і підтримувати прохід дайджесту.
2. Злийте і скрутіть шифон щипцями для повного проходження.
3. Розподіліть середовище для травлення у чотири конічні пробірки для центрифуги об'ємом 50 мл (

4. Ідентифікація маркерів поверхні стовбурових клітин з pADSC методом проточної цитометрії

5. Диференціація pADSC на адипоцити, остеоцити та хондроцити

6. Фарбування диференційованих адипоцитів, остеоцитів та хондроцитів

Репрезентативні результати

PADSC, отриманий із дорсальної підшкірної жирової тканини свиней, висівали на культуральні пластини або посуд і поміщали в 2. Показано, що морфологія pADSC із судинної фракції строми подібна до ADSC миші або людини. Через двадцять чотири години після висіву субконфлюентний pADSC відповідав і має розширену фібробластоподібну морфологію (2А). PADSC буде зливатися протягом 72 годин і готовий до адипоцитів або іншої диференціації мезенхімального типу (2 Б). pADSC демонструють сильний адипогенний потенціал після хімічної індукції, а зрілі адипоцити можуть диференціюватися через 9 днів, причому понад 90% pADSC демонструють адипогенну диференціацію (Малюнок 2C) дивитися.

Для вирішення властивостей pADSC, виявлених у цьому протоколі, поверхневі маркери pADSC оцінювали за допомогою аналізу проточної цитометрії. Як і в 3 показано є , Поверхневі маркери для мезенхімальних стовбурових клітин, включаючи CD29, CD44, CD90 та MHC I (або HLA I), були високо виражені. Негативні поверхневі маркери, такі як CD4a, CD31, CD45 та MHC II (або HLA II), навряд чи були виявлені в pADSC, отриманому в протоколі. (Малюнок 3). Ці результати вказують на те, що ці pADSC демонструють властивості стовбурових клітин мезенхімного типу без значного забруднення ендотеліальними або гемопоетичними стовбуровими клітинами, включаючи мієлоїдні або лімфатичні попередники.

Щоб переконатися, що pADSC представляють мезенхімальні стовбурові клітини, мультипотентність pADSC досліджували шляхом диференціації на адипоцити, остеоцити та хондроцити. Ці адипоцити, остеоцити та хондроцити забарвлювались специфічними барвниками, олійно-червоним O, алізариновим червоним S та толуїдиновим синім O, відповідно. (Малюнок 4). Ці дані вказують на те, що цей протокол продукував pADSC, які зберігали мутипотентність з повними характеристиками, подібними до попередників мезенхімального типу.

Рисунок 2. Морфологія pADSC з жирової області свинячої корейки. (A) Підконденсатний pADSC застряг і поширився після 24-годинного посіву на 6-лунковій культуральній пластині. (B) Через 72 год висіву pADSC став злитим на 6-лунковій культуральній пластині. (C) Зрілі адипоцити спостерігали через 9 днів адипогенної диференціації pADSC. Зображення, зроблені зі збільшенням у 100 разів, були фазово-контрастною мікроскопією. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 3. Ідентифікація стовбурових клітинПоверхневі маркери для pADSC. 1 х 105 pADSC вводили зі специфічними антитілами та аналізували на маркери стовбурових клітин методом проточного цитометричного аналізу. Цифри вказують на відсоток забарвлених клітин у популяції (червоний) порівняно з незабарвленим контролем. Вісь х представляє відносну інтенсивність флуоресценції. Вісь y представляє популяцію клітин. Клацніть тут, щоб побачити збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 4. Диференціація мультипотентного pADSC. Мультипотентність pADSC визначали шляхом диференціації pADSC на (A) Визначені адипоцити, (B) Остеоцити (C) Хондроцити та забарвлені репрезентативними барвниками, олійно-червоним O, алізариновим червоним S та толуїдиновим синім O, відповідно. Зображення були в (A) взято 100 х (B) 200 х і (C) Збільшено 100X за допомогою фазово-контрастної мікроскопії. Натисніть тут, щоб побачити більшу версію цього малюнка.

Обговорення

Тут ми представляємо надійну клітинну систему для вивчення розвитку жирової тканини в первинній культурі клітин pADSC. Порівняно з іншими безсмертними клітинними лініями, цей метод забезпечує зручний спосіб виділення великої кількості високоякісних дорослих мезенхімальних стовбурових клітин, які можуть бути використані для вивчення процесів диференціації адипоцитів або інших мезенхімальних ліній, пов’язаних з розвитком тварин in vivo. Важливим кроком у цьому модифікованому протоколі є те, що ми можемо отримати pADSC з 7-9-денним поросятком, оскільки з малими поросятами легко поводитися порівняно зі старими свинями та подібними до інших видів 19,20, що Урожайність та мультипотентність pADSC зменшується, коли свиням виповнився 21 рік.

Потенційні джерела стовбурових клітин включають ембріональні стовбурові клітини (ESC), індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPS) та постнатальні стовбурові клітини дорослих. Обмеження ADSC, класифікованого як дорослі мультипотентні стовбурові клітини, полягає в тому, що мультипотентність дорослих стовбурових клітин у різних диференціаціях ліній диференціації є відносно обмеженою порівняно з ESC або iPSC. Однак етичні питання щодо походження ESC та онкогенних властивостей iPS обмежують використання ESC та iPSC 22,23. Через це численні дослідники зосередилися на дорослих стовбурових клітинах, намагаючись поліпшити плюрипотентність. Найбільш поширеною причиною дорослих мезенхімальних стовбурових клітин (МСК), яка давно вивчалася, є мезенхімальні стовбурові клітини, одержані з кісткового мозку 24. Однак збирання кісткового мозку вважається відносно болючою процедурою. Інша проблема полягає в тому, що вихід стовбурових клітин з кісткового мозку є кінцевим. Аспірує кістковий мозок в середньому 6 × 10 6 ядерних клітин на мл, а MSC становить лише 0,001-0,01% всіх ядерних клітин. Розглянувши ці недоліки, ADSC пропонується як менш нав'язливе джерело для отримання 25,26 мультипотентних стовбурових клітин.

Подяка

Автори висловлюють подяку всім членам лабораторії за детальні обговорення та підтримку техніки у цьому протоколі. Дослідження, проведені в лабораторії, були підтримані грантами Міністерства науки і технологій (MOST 103-2314-B-002-126 та MOST 102-2313-B-002-026-MY3) та грантами від Aim для провідного університету -План підтримується (104R350144) Національний університет, Тайвань.

---