Використання протоколу Tomoauto A для високопродуктивної автоматизованої протокольної кріоелектронної томографії

Резюме

Ми представляємо протокол про те, як використовувати кріоелектронну томографію з високою пропускною здатністю для визначення структур in situ з високою роздільною здатністю молекулярних машин. Протокол дозволяє обробляти великі обсяги даних, дозволяє уникнути загальних вузьких місць та зменшити час простою ресурсів, що дозволяє користувачеві зосередитись на важливих біологічних проблемах.

Вступ

Системи секреції III типу (T3SS) є важливими детермінантами вірулентності для багатьох грамнегативних патогенів. Ін’єкціосома, також відома як голковий комплекс, є центральною машиною SST3, необхідною для прямої транслокації ефекторних білків від бактерій до клітин-хазяїв еукаріотичних 1, 2. Ін’єкціосома складається з позаклітинної голки, основного тіла та цитоплазматичного комплексу також відомий як трикомплекс 3. Попередні дослідження з'ясували тривимірні структури очищених ін'єктисом сальмонел та шигел, а також атомні структури основних білків базального тіла 4, 5. Останні структури in situ ін'єкцій сальмонел, шигел, та Yersinia були виявлені кріо-ET 6, 7. Однак цитоплазматичний комплекс, необхідний для відбору ефектора та голки, не був візуалізований у цих структурах.

Цей високопродуктивний трубопровід кріо-ЕТ був використаний для візуалізації неушкоджених ін’єкціосом у мініклітинах S. flexneri. За допомогою цього методу було створено в цілому 1917 томограм, що виявляло високу роздільну здатність інтактної машини in situ структури, включаючи цитоплазматичну сортувальну платформу, визначену середньою субтомограмою 19. При молекулярному моделюванні машин дикого типу та мутантів наша пропускна здатність трубопроводу пропонує новий шлях для розуміння структури та функції інтактної ін’єкції в рідній клітинному контексті.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Препарат мініцел

2. Підготовка сітки ЕМ

3.Автоматизована колекція серії High Tilt-Series

  1. Збірник планів малого збільшення
    1. Відкрийте нове вікно Навігатора, натиснувши "Відкрити" в меню "Навігатор" на SerialEM 10 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM)
    2. Знайти комірки сітки, які містять прийнятні умови зображення (наприклад, тонкий лід, відсутність забруднення, предмет, що цікавить) за допомогою флуоресцентного екрану з низьким збільшенням (

    4.Високошвидкісна автоматизована обробка та реконструкція серії Tilt із використанням Tomoauto

    5. Середня субтомограма

    ПРИМІТКА. Ми використовуємо пакет i3 з 15 (http://www.electrontomography.org/) для обробки експериментів із субтомографією середнього середовища, але описаний протокол, як правило, застосовується до більшості доступних експериментів із субтомографії на субтомограмах. програмних пакетів16 до, однак описаний протокол застосовується, як правило, доступний для більшості програмних суб-томограм для усереднення 16-18.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Міні-клітинні зразки S. flexneri збирали та обробляли, як показано звичайно схематичний малюнок 1, використовуючи наступний детальний трубопровід томоавто звичайно фігуру 2. Серії нахилу були зібрані за допомогою SerialEM 10, який дозволяє отримувати наскрізну послідовність з високою пропускною здатністю в призначених користувачем точках на стояках з низьким збільшенням. (рисунок 3). Мікрофотографії збирали за допомогою режиму фракціонування дози на камері прямого зондування для зменшення руху, спричиненого промінням 22 (Малюнок 4). Томоавто координує корекцію руху, роблячи колекцію мікроскопічних фотографій розділених доз обробки, кожна з яких використовує MOTIONCORR 22, і збирає результати у послідовний нахил, який буде оброблений пізніше (Фільм 1).

    tomoauto
    Рисунок 1. Схематичний огляд високопродуктивної кріоелектронної томографії. Рідку суспензію швидко заморожують на електромагнітній електромережі, а масив серій нахилу збирають за допомогою автоматизованого електронно-мікроскопа, керованого комп'ютером. Отримані мікрофотографії обробляються автоматично за допомогою томоавто для генерування томографії. Заключним кроком тут є сегментована мініцелла S. flexneri з томографії, створеної цим протоколом від Hu et al. 2015 15. Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.


    Рисунок 2. Блок-схема процесу томоавто. Розбивка потоку томоавто показує, як обробляються дані від колекції розділених доз мікроскопічних фотографій аж до середньої кінцевої субтомографії. Символи підпроцесу детально описують завдання, які томоавто координує для обробки введення, запустивши відповідне налаштоване програмне забезпечення. Символи вихідних даних, як правило, показують, що користувач не використовує їх, тоді як документи та багатосимвольні документи вказують на фактично маніпульовані користувачем вихідні дані. Нарешті символи на дисплеї показують, де відбувається втручання користувача у робочий процес. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 3. Придбання послідовного нахилу за допомогою SerialEM Navigator. Позиції монтажу карти зберігаються як позиції сцен (показано selectiON) у списку вікон Навігатора, що відображається в лівій частині екрана, а завантажена карта відображається у вікні буфера з виділеними точками, позначеними цифровим способом червоним хрестиком, доданим до картки отримання . Точки придбання перелічені за ярликом у вікні браузера, і їх можна встановити для отримання за допомогою вікна "Нахилити серію". Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 4. Вплив руху корекції на дані про розділену дозу. (Показано непокладена та виправлена ​​мікрофотографія та виправлене відео (оброблене MOTIONCORR) показано в (B), контраст трохи покращується після корекції. Покращення можна побачити більш очевидно, якщо подивитися на трансформацію Фурєрорма на мікрофотографії раніше (VS) і після (D) корекція руху. Зображення показують EH та сама інформація, але з мікрофотографією, нахиленою на 60 градусів, де контраст зменшується, а кільця Тона видно в С і D більше не видно при великому нахилі. Шкала шкали 250 нм. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 6. Томограма, що генерується автоматично томоавто. (Постер семирізочна проекція центру реконструкції нахилу серії, показаної в малюнок 4А. Шкала шкали 250 нм. (B) Збільшити огляд рамки в) показуючи неушкоджену ін’єкційну ін’єкцію. Смуга шкали 100 нм. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок середовища 7. Інтактна субтомографія S. flexneri система секреції III типу. (AT) центрального зрізу середньої 2,7 нм субтомограми інтактного S. flexneri SST3 EMDB (EMD-2667). (B) вздовж повної проекції вісь X об'єму. (VS) Ізоповерхневий рендеринг зчитаного обсягу при граничному порозі 130 при IMOD. Шкала шкали 5 нм. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Фільм 1: Анімація серійного нахилу (клацніть правою кнопкою миші, щоб завантажити). Ця анімація перетинає нахил серії, який спочатку збирав SerialEM. Трансляційні зміни легко ідентифікувати за нестабільним шляхом окремих маркерів реплік від зображення до зображення, і ці зміни з менш помітними недоліками повинні бути виправлені, перш ніж нахил серії можна буде відновити.

    Фільм 2: Анімація вирівняного нахильного ряду (клацніть правою кнопкою миші, щоб завантажити). Ця анімація проходить через ті самі мікрофотографії, що відображаються в Фільм 1 після автоматичного вирівнювання за допомогою томоавто. Фідуціарні маркерні нерівномірні шляхи тепер рухаються по плавному шляху завдяки нахилу серії, а вісь нахилу вирівняна вертикально до переглядача.

    Фільм 3:. Анімація реконструйованих серій нахилу (клацніть правою кнопкою миші, щоб завантажити) Ця анімація проходить через томографію дивитися Фігура 6 сформована після автоматизованої реконструкції нахилу відображеної серії в Фільм 2 від tomoauto.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Описаний тут метод з високою пропускною здатністю дозволив нам обробити серію кріо-нахилів 1917 року та виготовити понад 4500 субтомограмм інтактної ін’єкціономи S. flexneri 19. Зібрані дані призвели до детальної характеристики ін’єкціономи in situ, включаючи, зокрема, сортування цитоплазматичного комплексу. Цей метод також використовувався для візуалізації кількох мутантних клітин із специфічною делецією передбачуваних білкових компонентів, що дозволило з'ясувати склад платформи для сортування ін'єкціонів. Наш метод дав нові шляхи вивчення взаємозв'язку між структурою та функцією ін'єкціосоми. В результаті було встановлено наступний крок для подальшого розкриття основних механізмів секреції та патогенезу, опосередкованого SST3.

    Методи з високою пропускною здатністю дозволяють проводити масовий збір даних, що максимізує використання мікроскопа та комп’ютерних ресурсів, одночасно обмежуючи обсяг нудливих ручних втручань користувачів, які уповільнюють проект і виступають головною перешкодою. Бібліотека обгортки tomoauto була розроблена, щоб забезпечити повну конфігурацію всіх параметрів, що використовуються в кожному програмному забезпеченні, у простій та централізованій формі. Після того, як була визначена відповідна конфігурація, можна легко застосувати налаштування до всього набору даних. Більшість нахилів у серії можна вилікувати з прийнятними результатами (Малюнок 4А), тоді як вторинний підсборник повинен оброблятися вручну. Цей серійний перехід, як правило, є менш ідеальними придбаннями, які страждають від надмірної зміни зображення, відсутності контрасту або відсутності достатньої кількості фідуціарних маркерів, що змушує автоматичну процедуру відстеження реплік вийти з ладу. (рисунок 4B). Щоб отримати найкращі можливі томограми, слід дотримуватися значної обережності на кожному критичному етапі - від підготовки зразків, отримання зображень до обробки зображень.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автори заявляють, що не мають конкуруючих фінансових інтересів.

    Подяка

    Ми дякуємо доктору Вільяму Марголіну за коментарі. Ми вдячні за підтримку SerialEM від Dr. Девід Чень Сю та Мастронарде. DM, BH та JL підтримали грант R01AI087946 від Національного інституту алергії та інфекційних хвороб, грант R01GM110243 R01GM107629 від Національного інституту загальних медичних наук (NIGMS) та грант UA-1714 від фонду Welch. Прямий електронний детектор фінансувався Національною премією інститутів охорони здоров’я S10OD016279.