Використання внутрішньотрахеального введення PAMP та бронхоальвеолярного промивання для

Резюме

Імунна реакція господаря на інфекцію збудником хвороби - це жорстко регульований процес. За допомогою моделі експозиції ліпополісахаридів легенів у мишей можна проводити оцінку складних механізмів, пов'язаних з розвитком захворювання, з високою роздільною здатністю.

Анотація

Вступ

Описані протоколи є дуже гнучкими і можуть бути легко модифіковані для оцінки широкого спектра PAMP і пов'язаного з цим пошкодження молекулярних структур (ослаблене). Крім того, за допомогою кількох додаткових модифікацій, ці протоколи можуть також застосовуватися для досліджень, які показують прогресування алергічних захворювань дихальних шляхів або взаємодію збудника-господаря з живими бактеріями, вірусами або грибами 5-10.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Усі дослідження проводились за схваленням Комітету з догляду та використання (IACUC) для Virginia Tech та відповідно до Керівництва Національного інституту охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин.

1. Внутрішньотрахеальна (и) інокуляція ЛПС із введенням у ротоглотку

2. Збір сироватки та бронхоальвеолярного промивання (БАЛ)

900 мкл у трахею, надуваючи легені, і негайно виводячи HBSS. Помістіть задню БАЛФ у конічну пробірку об’ємом 15 мл.

  • Повторіть цей промивання ще 2 рази, щоб зібрати приблизно 3 мл BALF для подальшого аналізу. Зберігайте BALF на льоду або при температурі 4 ° C до використання.

    • 3. Підготовка до гістопатології

    1. Центрифугуйте цільну кров, зібрану на етапі 2.5, при 12000 xg протягом 5 хв для виділення сироватки. Сироватку у попередньо маркованій пробірці для мікроцентрифугування об’ємом 1,5 мл зберігають при -80 ° C
    2. Оцініть рівень цитокінів у сироватці крові за допомогою ІФА або подібного тесту. Розведіть сироватку від 1,05 до 1,20 у відповідному буфері для розведення залежно від аналізу відповідно до інструкцій виробника. Ці розведення слід визначати емпірично перед запуском більшості зразків.
    3. Через невеликий об'єм отриманої сироватки зменшуйте об'єм зразка на планшеті з ІФА при половинному завантаженні. Наприклад, більшість комерційних ІФА використовують 100 мкл обсягів стандартів та зразків. Для збереження зразків завантажте 50 мкл стандартів та розведеної сироватки на лунку.
    4. Центрифугуйте BALF у охолоджуваній настільній центрифузі при 200 г протягом 5 хв. Передайте безклітинний супернатант у дві попередньо мічені пробірки для мікроцентрифугування об’ємом 1,5 мл і зберігайте при -80 ° C.
    5. Оцініть цитокіни BALF методом ІФА або подібного тесту без розведення.
    6. Невикористана сироватка та BALF при -80 ° C

    5. Диференціальне фарбування та оцінка клітинності BAL

    6. Оцінка гістопатології

    1. Підготуйте легені до гістопатології. Через 24-48 год фіксації формаліном цілі надуті легені орієнтуються вентрально і вкладаються в парафін. Виріжте блоки, щоб виявити отримані основні шляхи потоку.
    2. Для підвищення точності підрахунку балів слід розташувати легені в одному положенні та обрізати кожен блок, що призводить до максимальної поздовжньої візуалізації головних внутрішньолегеневих осьових дихальних шляхів. З цього моменту виріжте 5 мікрон послідовних зрізів і фарбуйте гематоксиліном та еозином (H&E). Додаткові зрізи можна вирізати та підготувати до гібридизації in situ за допомогою стандартних протоколів.
    3. Оцініть гістопатологію, використовуючи напівкількісну систему оцінки, засновану на таких запальних параметрах, які оцінюються між 0 (відсутні) та 3 (важкі): мононуклеарна та поліморфно-ядерна інфільтрація клітин; Гіперплазія та пошкодження клітин епітеліальних клітин дихальних шляхів; Екстравазація; периваскулярні та перибронхоолярні тики; і відсоток легенів, які беруть участь у запаленні. Гістопатологію легенів повинен оцінювати досвідчений патолог.
    4. Усередніть значення всіх параметрів, щоб сформувати загальний бал гістопатології, або використовуйте індивідуальні бали для кількісної оцінки конкретних аспектів прогресування захворювання. Робіть усі оцінки подвійним сліпим способом, а рецензенти засліплюють як генотип, так і лікування. Раніше система балів була описана 6,7,10.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Введення ЛПС індукує високий рівень місцевих та системних прозапальних медіаторів, включаючи кілька цитокінів, пов’язаних із вродженою імунною відповіддю. Місцеві рівні цитокінів у BALF оцінюються за допомогою звичайних методів, таких як ІФА. Загальні цитокіни, які регулюються в легенях після введення ЛПС, включають TNF-α, IL-1β та IL-6 (Рис. 2А). Системний рівень цитокінів у сироватці крові з використанням тієї самої методики, що і оцінка BALF (2 Б) описано, оцінено. Нерідкі випадки, коли деякі медіатори присутні в місцевому мікросередовищі, але присутні в сироватці крові. Наприклад, TNF-α зазвичай виявляється на високому рівні в легенях після ЛПС, але, як правило, не виявляється системно за умов, описаних у цьому протоколі (Рис. 2А і 2 В; нижче межі виявлення).

    внутрішньотрахеального
    2. Вплив ЛФС на дихання призводить до підвищення рівня місцевих та системних цитокінів. А) Після впливу ЛПС місцеві рівні широкого спектру прозапальних цитокінів можуть спостерігатись у БАЛФ протягом перших 24 годин, включаючи TNF-α, IL-1β та IL-6. Ці цитокіни можна оцінити за допомогою ІФА, як показано тут, через 24 години після впливу ЛПС. Б) Кілька цитокінів також можна систематично виявити в сироватці крові. Однак є кілька винятків, включаючи TNF-α, які знаходяться у високій концентрації в BALF в сироватці крові, але ні. Цітокіни, що представляють інтерес для сироватки, слід оцінювати емпірично перед широкомасштабною оцінкою. Клацніть тут для більшого перегляду .

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Основними етапами успішної оцінки імунної відповіді в легенях миші є наступні: 1) вибір відповідного штаму миші та статі для моделі, що оцінюється; 2) оптимізація доставки ПАМФ до легенів; 3) правильно збирати та обробляти БАЛФ; та 4) правильно зафіксувати та підготувати легені до гістопатологічних досліджень.

    Встановлено, що введення в ротоглотку є більш точним, ніж інші форми доставки ліків до легенів 2. Це значною мірою пов’язано з прямим доступом до дихальних шляхів та обходом проблем, пов’язаних з відкладенням носа та верхньої щелепи. Однак, як і у випадку з усіма випробуваннями на тваринах, для досягнення управлінських знань потрібні великі навички та практика. Неправильна техніка може призвести до неефективності легенів, а в деяких випадках і до травмування тварин. Як правило, синій барвник Evans (EBD) можна ефективно використовувати або як навчальний інструмент для цієї процедури, або для усунення можливих проблем, пов’язаних із заповненням 4. EBV можна вводити, а потім витягувати з тканини за допомогою формаміду. Кількість EBD можна розрахувати, використовуючи рівні поглинання порівняно зі стандартною кривою. У наших руках типове відновлення ВБД коливається між 90-98%. Зазначається, що більша частина невсмоктуваного барвника пов’язана з витоком у стравохід. Завдяки своїй точності технологія адміністрування ІТ ідеально підходить для доставки різноманітних дозочутливих речовин до легенів, таких як активні фармацевтичні інгредієнти або інфекційні організми.

    t "> Ця процедура оптимізована для доставки LPS та інших PAMP до легенів мишей. Після засвоєння цих методів додаткові дослідження також можуть бути ініційовані за допомогою модифікованих протоколів для ефективної оцінки взаємодії хазяїн-збудник з живими патогенами. Описані методи дуже універсальні і можуть бути використані для будь-якого дослідження, що цікавить оцінку клінічної та фізіологічної значимості експериментального або фармацевтичного агента. Завдяки точності дозування ця методика також ідеально підходить для досліджень in vivo, які вимагають високих рівнів Точність у фінансуванні.

    Ця процедура оптимізована для доставки LPS та інших PAMP до легенів мишей. Після засвоєння цих методів також можуть бути ініційовані додаткові дослідження з використанням модифікованих протоколів для ефективної оцінки взаємодії хазяїн-збудник з живими патогенами. Аналогічно, методи, описані тут, є дуже універсальними і можуть застосовуватися до будь-якого дослідження, зацікавленого в оцінці клінічної та фізіологічної значущості експериментального або фармацевтичного агента. Через точність дозування ця методика також потрібна для досліджень in vivo, які вимагають високого ступеня точності доставки активних речовин.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Розкриття інформації

    Автори заявляють, що відсутні конкуруючі фінансові інтереси.