Виробництво чистої культури - мікробіологічне стажування

У цьому експерименті слід застосовувати та випробовувати різні методики розведення мазка (13-лінійний та 3-петльовий метод мазка) з метою отримання чистих мікробних культур.

3-петльовий метод мазка:
Тут також петлю інокуляції відпалюють і охолоджують на краю пластини, яку потрібно щепити, перед тим, як інокулят виймається із зразка для розведення. Прищеплювальна петля з посівним матеріалом злегка кладеться на агар, а потім розкладається від краю до краю, але, не торкаючись його, «зигзагоподібним рухом» приблизно на третину до половини пластини. Петлю щеплення знову відпалюють, охолоджують, чашку Петрі повертають приблизно на 90 °, а потім мазок наносять так, щоб матеріал розміщувався за першим мазком, матеріал підбирається ним, проводячи по ньому, і цей матеріал пропускається на пластину поширюється ще один "зигзагоподібний рух". Петлю щеплення знову відпалюють, охолоджують, чашку Петрі повертають приблизно на 90 ° і наносять третій мазок, аналогічний процедурі другого мазка. Наступний ескіз призначений ще раз проілюструвати техніку 3-вушкової лінії:

1 тиждень
У цьому експерименті змішана культура с Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens і Rhodotorula glutinis двома різними методами мазка, 13-лінійним методом і 3-петльовим методом, на трьох різних культуральних середовищах (HPG, KB та YGC-агар) проводять фракціоновані мазки. З цією метою вже залиті та готові до вживання агарові пластини спочатку маркували на нижній стороні чашок Петрі.
Поживні середовища мали такий склад:

Агар HPG
на 1000 мл аква демін. були додані:

5,0 г дріжджового екстракту
5,0 г пептона з м’яса
0,25 г глюкози
15 г агару

РН доводили до 7,2.

Агар YGC
на 1000 мл аква демін. були додані:

5,0 г дріжджового екстракту
20,0 г D (+) глюкози
0,1 г левоміцетину
14,9 г агару

РН доводять до 6,6.

Агар короля В (KB)
на 1000 мл аква демін. були додані:

20,0 г протеази пептон
10,0 г гліцерину (чистий)
1,5 г сульфату магнію (MgSO4)
1,8 г 3-гідрату трикалієвого фосфату (K3PO4 × H2)
15,0 г агару

РН доводили до 7,1.

З кожної з перерахованих агарових пластинок по одній інокулювали методом 13 ліній, а іншу - методом три лінії, так що було отримано 6 агарових пластин. Для цього клітинна суспензія забезпечена змішаною культурою Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens і Rhodotorula glutinis Добре перемішайте зі змішувачем для пробірки, потім охолодіть відпалений прищеплюючий контур на краю агарової пластини KB, вийміть посівний матеріал із суспензії та нанесіть його на агарову пластину методом 13 рядків. Агар HPG та агар YGC також інокулювали інокулятом із змішаної культури методом 13 ліній. Потім змішану культуру змащували методом 3-петльового мазка, причому агар KB, YGC та HPG інокулювали один за одним петлею інокуляції. Потім інокульовані агарові пластини інкубували догори дном: пластини HPG протягом 2 днів при 25 ° C, пластини YGC при 25 ° C протягом приблизно 5 днів і планшети KB при 25 ° C протягом 3 днів.

3 тижні
На третьому тижні проводили контроль мазка серії мазків, знову звертаючи увагу на однорідність, ізоляцію та морфологічні характеристики колоній, а також забруднення.
На наступному кроці чиста культура Росії Pseudomonas fluorescens по одній підготовленій культурі агару та одній кріокультурі.
Надана похила трубка була заповнена агаром HPG (склад див. Вище), і кріомедіум мав такий склад:

Кріомедіум

0,5 мл поживного розчину
0,5 мл 85% гліцерину
3 скляні намистини (з ремесел)

Поживне середовище, що міститься в кріомедіумі, мало такий склад:

Живильне середовище
на 1000 мл аква демін. були додані:

5,0 г м'ясного пептону
3,0 г м’ясного екстракту

РН доводять до 7,0.

5-й тиждень
На п’ятому тижні всі пластини макроскопічно досліджували та перевіряли на чистоту, однорідність та забрудненість. Крім того, всі агарові пластинки досліджували на флуоресценцію під УФ-лампою (366 нм). Деякий клітинний матеріал суспендували з мазка кріокультури на агарі HPG, а його посівний матеріал наносили на очищене предметне скло мікроскопа, і цей мазок після висихання мікроскопічно збільшували 400 разів у світлому полі (див. 4-й тиждень). Агарова пластина KB з мазка посівної агарової культури та агарова пластина HPG з кріокультури були відкладені та використані для тесту на каталазу в експерименті D2.

2 тижні
Ріст окремих мікроорганізмів розвивався по-різному: агар YGC був переважно з Rhodotorula glutinis, агар КБ переважно с Pseudomonas fluorescens і агар HPG переважно с Bacilus subtilis зарослий.
Контроль мазка на агарових пластинах HPG, YGC та KB методом 3-петльового мазка та 13-лінійним методом дав результати, показані в наступних таблицях:

Таблиця 3: забруднення Агар: KBYGCHPG

+: забруднення -: відсутність забруднення Прізвище: Назва забруднювача
13-рядковий метод:	+	P. fluorescens	+
3-петльовий мазок:	-	+	-

Результати характеристики морфології колонії представлені в наступній таблиці:

Таблиця 4: Морфологія колонії ColorDiameterShapeRandProfileSurfaceConsistencyCulture середовища знебарвлення

YGC: Rhodotorula glutinis	червоний	1-2 мм	круглі	гладкий	опуклі	гладка, блискуча	здобний	-
КБ: Pseudomonas fluorescens	Білий	1-4 мм	круглі	гладкий	квартира	грубий	гелеподібні	-
HPG: Bacilus subtilis	Білий	1-2 мм	круглі	гладкий	опуклі	гладка, блискуча	слизовий	-

3 тижні
Контроль мазка другого мазка розведення на агарі HPG дав такий результат:

Rhodotorula glutinis: забруднений (забруднювач Ризобій Спори), хороша ізоляція колоній
Pseudomonas fluorescens: забруднений (забруднювач Ризобій Спори), відсутність ізоляції колоній
Bacillus subtilis: відсутність забруднення, хороша ізоляція колоній

4-й тиждень
Перевірка чистоти агарової похилої культури Росії Pseudomonas fluorescens дав такий результат:

Флуоресценція: Ну
Макроскопічна однорідність: Ну
Мікроскопічна однорідність: Ну

5-й тиждень
Контроль мазка кріокультури та похилої культури Росії Pseudomonas fluorescens на агарі KB та HPG дав такий результат:

Нахил агару KB: флуоресцентні, макроскопічно однорідні, забруднення відсутні
Нахил агару HPG: флуоресцентні, макроскопічно однорідні, забруднення відсутні
Кріо КБ: флуоресцентні, макроскопічно однорідні, забруднені РизобійКріо HPG: флуоресцентні, макроскопічно та мікроскопічно однорідні, забруднення відсутні

Також було встановлено, що жовте забарвлення колоній було більш вираженим на агарі KB, ніж на агарі HPG. Ріст на кріокультурних плитах також був сильнішим, ніж на агарових похилих мазках культури.

Білл:
Для гліцерину (C3H8O3) давали масу 10 г.
Молярна маса C3H8O3 є результатом:
(12u * 3) + (16u * 3) + (1u * 8) = 92u 92 г/моль
Маса 10 г на 1 л призводить до молярної концентрації:
10 г/92 г/моль = 0,1086 моль/літр

Для трикалієвого фосфат-3-гідрату (K3PO4 x 3 H2O) давали масу 1,8 г на 1000 мл.
Молярна маса K3PO4 x 3 H2O є результатом:
(39u * 3) + (31u * 1) + (16u * 4) + (6u * 1) + (16u * 3) = 266u 266 г/моль
Отже, маса 1,8 г на л відповідає молярній концентрації:
1,8 г/266 г/моль = 0,0677 моль/літр

Для сульфату магнію MgSO4 давали масу 1,5 г на 1000 мл.
Молярна маса MgSO4 є результатом:
(24,3u * 1) + (32u * 1) + (16u * 4) = 120,3u 120,3 г/моль
Отже, маса 1,5 г на л відповідає молярній концентрації:
1,5 г/120,3 г/моль = 0,0125 моль/літр

У цьому експерименті каталазна активність різних бактеріальних культур (Pseudomonas fluorescens і молочнокислі бактерії).

Кисень у своїй молекулярній формі як молекула O2 має токсичну дію на всі живі клітинні системи завдяки своїй окислювальній дії, а також відомий як клітинна отрута. Це ще більше стосується анаеробних організмів, оскільки вони не використовують кисень як кінцевий акцептор електронів дихального ланцюга і, отже, не можуть зробити його нешкідливим у формі води (H2O). Активація кисню може приймати 3 різні форми, всі з яких каталізуються так званими оксидазами і в яких утворюються такі проміжні продукти:

O2 + 4 e - -> O 2- + O 2- оксидні іони
O2 + 2 e - -> O2 2- іон перекису
O2 + 1 e - -> O2 - супероксид-іон

Для цих іонів кисню те, що було знайдено для молекулярного кисню, стосується ще більшої міри: це дуже реактивні реактиви, які можуть назавжди пошкодити клітину та її компоненти. Ось чому більшість організмів мають ферментні системи, які роблять проміжні продукти, що виникають в результаті зменшення кисню, нешкідливими. Іони оксиду реагують з протонами, утворюючи воду, яка нешкідлива для клітини, іони перекису реагують з протонами Н +, утворюючи пероксид водню (H2O2), який також є дуже реактивним і шкідливим для клітини. Супероксид-іон реагує з перекисом водню та протонами водню, утворюючи молекулярний кисень, воду та гідроксильний радикал, який у свою чергу є токсичним для клітини. Подальші реакції активації кисню знову перелічені нижче:

Для того, щоб зробити пероксид водню нешкідливим, більшість аеробних організмів мають фермент каталазу, яка розщеплює H2O2 до води та молекулярного кисню:

Є також пероксидази, здатні детоксифікувати перекис водню шляхом протонування:

Щоб уникнути утворення гідроксильних радикалів, аеробні та аеротолерантні організми мають фермент супероксиддисмутазу, який перетворює супероксидний іон від активації кисню в дещо менш шкідливу перекис водню та молекулярний кисень:

Анаеробні організми зазвичай не мають цих ферментних систем.
Реакція каталази використовується для характеристики мікроорганізмів завдяки можливості спостерігати за виділенням газу з молекулярного кисню в організмах, які мають цей фермент. Ця реакція може бути використана для розрізнення аеробних та анебробних, а в основному також від аеротолерантних організмів. [2]

У цьому експерименті використовували відкладені агарові пластинки мазків Pseudomonas fluorescens з експерименту D1 (агар KB з косої культури агару та агарова пластина HPG з кріокультури), а також агарові пластинки з мазків молочнокислих бактерій з експерименту H (агар M17 Стрептокок і агар Рогоза с Лактобактерії) піддані тесту на каталазу. Для цього першу з агарових пластин клали прямо на лабораторний стіл, кришку чашки Петрі знімали і 3% розчином перекису водню (H2O2), доступною з невеликої колби Ерленмейєра, заливали її так, щоб агар рівномірно покривався рідиною. Потім коротко чекали, чи було виділення газу в рідині над агаром, і результат зазначався. Всі агарові пластини тестували за однаковою процедурою. Випробувані агарові пластини утилізували в автоклавних відходах.

Як тест каталази з агаром КБ культури похилого агару, так і агар HPG у кріокультурі були позитивними, тобто візуально було виявлено сильне виділення газу, яке характеризувалось бурхливим піноутворенням і утворенням бульбашок рідини. Обидві агарові пластини (агар М17 с Стрептокок і агар Рогоза с Лактобактерії) експерименту Н ніякого виділення газу не виявлялося.

В результаті цього експерименту можна констатувати, що Pseudomonas fluorescens Каталаза позитивна і тому має захисний фермент каталазу, тоді як молочнокислі бактерії Стрептокок і Лактобактерії Каталаза негативна і не має ферменту каталази. Таким чином може Pseudomonas fluorescens класифікувати як аеробний організм, а молочнокислі бактерії як принаймні аеротолерантні або навіть анаеробні організми.
Слід також зазначити, що вироблений газ також можна збирати та піддавати подальшим дослідженням, щоб перевірити, чи насправді це кисень (O2).