Високочастотна ультразвукова ехокардіографія для оцінки протоколу серцевої функції Zebrafish
Резюме
Ми описуємо протокол для оцінки морфології та функції серця у дорослих даніо за допомогою високочастотної ехокардіографії. Метод дозволяє візуалізувати серце та подальшу кількісну оцінку функціональних параметрів, таких як частота серцевих скорочень (ЧСС), серцевий викид (СО), фракційна зміна зони (КДК), частка викиду (ЗВ) та швидкості. Приплив та потік крові.
Анотація
Вступ
У даніо дані серце розташоване вентрально в грудній порожнині безпосередньо ззаду від зябер, а передсердя розташоване дорсально до шлуночка. Передсердя збирає венозну кров із синуса венозуса і передає її в шлуночок, де потім перекачується до артерії бульба(Фігура 1). Тут ми описуємо фізіологічний підводний протокол для оцінки серцевої функції у дорослих даніо за допомогою неінвазивної ехокардіографії з використанням лінійного ультразвукового зонда з центральною частотою 50 МГц для візуалізації в режимі B з роздільною здатністю 30 м. Оскільки ультразвукові хвилі можуть легко рухатися по воді, підтримка близькості між рибою та підводним скануючим зондом забезпечує достатню площу контакту для серцевого зондування без необхідності ультразвукового гелю і в цілому є менш стресовим для риб. Незважаючи на те, що декілька авторів 9, 12, 13 повідомляли про альтернативні системи ехокардіографії даніо, тут ми представляємо загальну та найбільш часто використовувану установку, яка застосовується до високочастотного ультразвуку у тварин.
Метод дозволяє робити зображення з високою роздільною здатністю серця дорослих даніо, відстежуючи серцеві структури та кількісно визначати пікові швидкості доплерівського вимірювання кровотоку. Ми показуємо надійну кількісну оцінку in vivo важливих систолічних та діастолічних параметрів, таких як фракція викиду (EF), фракційна зміна сектора (FAC), приплив та швидкість потоку шлуночкової крові, частота серцевих скорочень (ЧСС) та серцевий викид (CO). Ми допомагаємо встановити надійний діапазон здорових функціональних та розмірних параметрів дорослих даніо, щоб забезпечити більш точну оцінку стану захворювання. Загалом, ми пропонуємо надійний метод оцінки роботи серця у даніо, який, як виявилося, є надзвичайно корисним для створення та перевірки моделей серцевих захворювань 6, 16, пошкодження та відновлення серця 10, 13 та регенерації 11, 12 та може бути надалі використана для оцінки потенційних наркотиків.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Усі процедури даніо схвалені нашим інституційним комітетом з догляду та використання тварин та відповідають Закону США про захист тварин.
1. Експериментальна установка
2. Обробка риби
ПРИМІТКА: Данилою, використаною у цьому дослідженні, був 11-місячний дорослий самець дикого типу штаму AB/Tuebingen (AB/TU). Рибки даніо утримувались в окремій акваріумній системі при 28 ° C при постійному світловому циклі, встановленому як 14 годин світла/10 годин темряви. Риб-даніо годували двічі на день солонованими креветками (Artemia nauplii) та сухими кормовими пластівцями.
3. Отримання зображень
ПРИМІТКА: Див таблиця матеріалів для системи обробки зображень та програмного забезпечення для аналізу зображень.
4. Оздоровлення риби
- Як тільки отримання зображення завершиться, за допомогою чайної ложки переведіть рибу в звичайну систему газованої води, вільну від трикаїну, і дайте можливість рибі відновитись (зазвичай для відновлення руху в плечі та плавання потрібно 30 с до 2 хв).
- Щоб полегшити відновлення, кілька разів бризкайте водою на зябра за допомогою піпетки для перенесення, щоб полегшити аерацію води та перенесення кисню.
5. Аналіз зображення
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Описаний протокол дозволяє вимірювати важливі розмірні та функціональні параметри серця, аналогічно методиці, що використовується в ехокардіографії людини та тварин. Зображення в режимі В дозволяють простежити внутрішню стінку шлуночка в систолі та діастолі (рис.5) та отримати дані про розміри, такі як розміри камери та стінки, та функціональні дані, такі як частота серцевих скорочень, ударний об’єм та серцевий викид, а також параметри систолічної функції шлуночків, такі як зміна зони дробу та фракціонування фракціонування(таблиця 1). Вимірювання на атріовентрикулярному клапані за допомогою кольорових доплерівських зображень також забезпечує швидкість входу та виходу з шлуночка (швидкість, з якою кров наповнюється і виходить із шлуночка відповідно) (Рисунок 3 і таблиця 1).
Параметри, отримані в цьому дослідженні, були порівнянні з тими, що повідомлялись у попередніх дослідженнях, використовуючи подібні експериментальні умови 6, 16, 17 (табл1), додатково демонструючи відтворюваність методу. Загалом, ми показуємо, що за допомогою цього детального протоколу можна ефективно та послідовно оцінювати серцеву функцію данио, що є важливим при порівнянні різних серцевих фенотипів під час дослідження.
Рисунок 1: Ілюстрація серця дорослих даніо. Циркуляція кровотоку представлена стрілками: кров тече від синусового пазухи до передсердя і передається у шлуночок, де перекачується до цибулинної артеріозу. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 2: Камера для зображення риби. (AT) Для підготовки «камери» для зображення риби в скляну ємність поміщають губку з розрізом до одного кінця у вертикальній орієнтації. () Скляну ємність потім надійно приклеюють до нахиленої платформи зображення. (VS) Перетворювач встановлений на маніпуляторі та розміщений паралельно розрізу для правильного розташування зображення (виїмка перетворювача вказує на оператора). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 3: Атріовентрикулярний приплив (A) та відтік (B) у кольоровому допплері та відповідний доплерівський режим пульсової хвилі для оцінки швидкостей відповідних шлуночкових діастолічних піків (C) та шлуночкового відтоку (D). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 4: Аналіз зображення. Після обробки зображення (для досягнення бажаної контрастності та яскравості зображення) вимірювання можна виконувати в режимах PW-доплера (ліворуч) та B-режимі (праворуч). Щоб намалювати стіну НН на зображенні в режимі B, виберіть Сердечний пакет у меню, що випадає, перейдіть до ПСЛАКСі виберіть LV Trace. Щоб виміряти пікові швидкості на зображенні в режимі PW-доплера, виберіть Сердечний пакет у меню, що випадає. Щоб виміряти швидкість шлуночкового кровотоку, виберіть опція MV Flow і виберіть Е або AT для ранньої діастоли та пізньої діастоли відповідно. Щоб визначити швидкість кровотоку, виберіть Потік AoV і Максимальна швидкість AV. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Рисунок 5: Зображення в режимі B. (AT) B-Mode зображення шлуночка (V) у діастолі, наповненого кров’ю з передсердя (A). () B-Mode зображення шлуночка в систолі, що викидає кров через bulbus arteriosus (B, зелена трасування). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 6: Зображення імпульсної доплерівської хвилі. Значення пульсу може бути сформовано шляхом побудови 3 послідовних піків аортального потоку. Пік потоку аорти можна переглянути, натиснувши кнопку частота пульсу на вкладці вимірювань у програмному забезпеченні для аналізу. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
| Параметри, одиниці виміру та sd | Це дослідження | Ванг, Л. та ін., 2017; Lee, L. et al., 2016 та Mishra, S. et al, 2019 | Коментарі/Опис |
| ЧСС (ЧСС), уд./Хв | Від 133 до 7 | 118 - 14 - 162 - 32 | Дикі тварини типу AB/ABTU та самки від 3 до 12 місяців знеболюють трикаїном 0,2 мг/мл |
| Фракційна зміна зони (FAC) | Від 0,38 до 0,03 | 0,29 - 0,07 - 0,39 - 0,05 | |
| Фракція викиду (EF), [%] | Від 42 до 7 років | Від 34 до 0,04 - від 48 до 0,03 | |
| Ударний об'єм (SV), L | Від 0,21 до 0,01 | 0,18-0,06 - 0,28-0,08 | |
| Серцевий викид (CO), 'L хв-1 | Від 27,3 до 1,69 | 19 від 9,5 до 36,1 до 7,8 | |
| Пікова швидкість E (ранній шлуночковий приплив), мм/с | Від 30 до 6,8 | Від 25 до 7 - від 51 до 16 | |
| Максимальна швидкість (пізній шлуночковий вхід), мм/с | 152 - 32 | Від 144 до 36 - від 288 до 54 | |
| Виведення шлуночків, мм/с | Від 86,6 до 19 | н/д |
Таблиця 1: Ехокардіографічні показники у дорослих даніо. Значення, отримані для параметрів серцевої функції, оцінені в поточному дослідженні для дорослих самців або жінок-даніо у віці від 3 до 12 місяців, знеболених у розчині 0,2 мг/мл трикаїну. Діапазон значень, отриманих для тих самих параметрів у попередніх дослідженнях 6, 16, 17, виконаних за подібних умов, представлений для перевірки та для стандартизації методу.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Позиція сканування: У цій конфігурації можливі два положення сканування: поздовжня вісь і коротка вісь. Ми виявили, що в режимі короткої осі було дуже важко ідентифікувати камери серця. Тому ми використовували лише поздовжню вісь і рекомендуємо останню для окреслення серцевих камер В-режиму та визначення розмірів та функції шлуночків.
Знеболення: Адекватна седація необхідна для уникнення сильної брадикардії під час вимірювання. Частота серцевих скорочень вплине на вимірювання серцевої діяльності, погіршуючи точність дослідження. Трикаїн є найпоширенішим знеболюючим засобом, і показано, що доза 0,2 мг/мл забезпечує адекватну седацію. Однак час вимірювання є критичним, оскільки частота серцевих скорочень починає зменшуватися через 3-4 хв під седацією 16. Щоб уникнути мінливості, важливо тримати вимірювання протягом 3 хв.
Критичні параметри: Частоту серцевих скорочень можна вважати критичним параметром, якщо говорити про послідовність і точність. Частота серцевих скорочень повинна бути порівнянною між експериментальними групами та в межах діапазону значень, що застосовуються для використовуваних умов. Ми виявили, що діапазон від 118 до 14 до 162 - 32 ударів на хвилину може представляти нормальні значення для дорослих данишків дикого типу 3-12 місяців, знеболених 0,2 мг/мл трикаїну менше 3 хв.
Точність результату: Для забезпечення точності вимірювання слід проводити протягом щонайменше 3 серцевих циклів. Для отримання більш точних слідів ручного зображення аналіз слід проводити наосліп.
Окрім вибору найбільш підходящих умов, для забезпечення точного вимірювання важливими є кілька аспектів. В ідеалі умови повинні підтримуватися якомога ближче до нормального фізіологічного стану риби. Виконання аналізу під водою має перевагу утримувати рибу в природному середовищі та майже нормально для газообміну, складу води, гідростатичного тиску та температури. Це очевидні переваги порівняно з попередніми дослідженнями, коли під час підмітання рибу поміщають у мокру губку, що піддається впливу кімнатного повітря, а провідність активується ультразвуковим гелем замість води 9, 10. Підводне підмітання також дозволяє відновити рибу після процедури, за умови, що час між анестезією та відновленням не перевищує 3 хв і риба повертається у воду для відновлення відразу після вимірювання. Щоб процедура була виконана якомога швидше та ефективніше, перед проведенням будь-яких експериментів рекомендується проводити значну кількість часу на тренування.
Ехокардіографія дозволяє провести повну характеристику серцевого профілю риби та кількісно визначити кілька функціональних параметрів. Отримані значення для фракції, що викидається, зміни фракційної зони, кровотоку та швидкості потоку, частоти серцевих скорочень та серцевого викиду знаходяться в межах діапазону, про який повідомляли попередні дослідження (таблиця 1), підкреслюючи відтворюваність методу. У сукупності наші дані показують, що високочастотна ультразвукова ехокардіографія є надійним і відтворюваним методом для вимірювання серцевої морфології та функції даніо при оцінці особливостей захворювання або тестуванні на наркотики.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.