Вплив осадження цинку та ліпідів на 3,2-еноїл-КоА ізомеразу та вибрані характеристики
1 Вплив осадження цинку та ліпідів на ізомеразу 3,2-еноїл-КоА та обрані особливості ліпідного обміну вирощуваних щурів Дженніфер Юстус Інавгураційна дисертація на здобуття наукового ступеня доктора наук (доктор економічних наук) на факультеті сільськогосподарських наук, екотрофології та управління навколишнім середовищем Justus- Університет Лібіха Гіссен
3 Інституту харчування та фізіології харчування при Університеті Юстаса Лібіха в Гіссені Вплив осадження цинку та ліпідів на Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА ізомеразу та вибрані характеристики ліпідного обміну у вирощуваних щурів Інавгураційна дисертація на здобуття докторської ступеня . troph.) на факультеті 09 - Сільськогосподарські науки, екотрофологія та управління навколишнім середовищем Університету Юстуса Лібіха в Гіссені, подані дип. трофей. Дженніфер Юстус Гіссен 2007
4 Дисертація на факультеті сільськогосподарських наук, харчових наук та управління навколишнім середовищем Університету Юстуса Лібіха в Гіссені Декан: проф. Екзаменаційний комітет Р. Геррмана: Голова: проф. І. Гофманн 1-й рецензент: проф. Е. Вейганд 2-й рецензент: проф. Й. Паллауф Експерт: професор д-р Г. Брюкнер Експерт: PD Dr. День диспуту С.Рудлоффа: 22 січня 2007 р
5 Зміст I Зміст Перелік рисунків. IV Список оглядів. V Перелік таблиць та рисунків у додатку. VII Список скорочень. IX 1 Вступ Дефіцит цинку та його вплив на ліпідний обмін Мікроелемент цинк Дефіцит цинку Біологічні функції цинку Метаболізм цинку та визначення статусу цинку Регулювання експресії генів цинком Зміни ліпідного обміну та специфічний метаболізм ненасичених жирних кислот Зміни ліпідного обміну при дефіциті цинку Деградація ненасичених жирних кислот та функція Δ 3, Δ 2 -Еноїл-КоА ізомераза Експресійно-модулюючий потенціал ненасичених жирних кислот Експериментальна частина Питання Опис експерименту Склад експериментальних дієт Отримання та обробка аналітичного матеріалу Аналітичні методи Гемоглобін, гематокрит Вміст жиру у фекаліях Визначення концентрації цинку Активність концентрації білка Δ 3, Δ 2 -Еноїл-КоА ізомераза Відновлення мітохондріальних фракцій Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА ізомераза аналіз аналіз сукцинатдегідрогенази аналіз експресії гена екстракція загальної РНК. 37
6 II Зміст RT-PCR електрофорез у агарозному гелі та оцінка оптичної щільності Ліпідний профіль Ліпідів плазми Ліпідний профіль печінки Жирно-кислотна структура ліпідних фракцій печінки Кетонові тіла в плазмі та сечі Статистична оцінка результатів експерименту Вживання корму, розвиток живої ваги, перетворення кормів та засвоюваність жиру Цинковий стан та гематологічні параметри Активність Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА-ізомераза мрна-експресія Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА-ізомерази та PPARs альфа- та гамма-ліпідні ліпідні фракції плазми жирної кислоти у печінці ліпідні фракції кетонових тіл Обговорення Коментар до моделі тваринного Зростання та статус цинку у досліджуваних тварин Вплив седиментації цинку та ліпідів на активність та експресію Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА ізомерази Вплив експресії PPARalpha, PPARgamma та концентрації кетонового тіла Вплив на ліпідний профіль плазми та печінки Вплив цинку - та осадження ліпідів на структурі жирних кислот загальних ліпідів, тригліцеридів та фосфоліпідів печінки Висновок Резюме Бібліографія Додаток. 106
7 Зміст III Короткий зміст Анотація Пояснення. 136
10 VI Зміст Огляд 23: Огляд 24: Огляд 25: Огляд 26: Огляд 27: Відносний вміст загальних ліпідів, холестерину, тригліцеридів та фосфоліпідів у печінці (мг/100 г живої маси). 59 жирних кислот із загальної кількості ліпідів печінки (г/100 г загальної кількості жирних кислот). 61 жирна кислота загальних ліпідів печінки (мг/г печінки FM). 64 жирні кислоти печінкової фракції тригліцеридів (г/100 г загальних жирних кислот). 66 жирних кислот печінкової фосфоліпідної фракції (г/100 г загальних жирних кислот). 67
12 VIII Зміст Таблиця A 23: Таблиця A 24: Концентрації 3-гідроксибутиратів у плазмі та сечі періоду збору FS метиловий ефір у суміші FAME C4-C24 (18919, Sigma) Таблиця A 25: Дані LCQ Рисунок A 1: Молекулярна структура і молекулярна маса транс-3-гексеноїл-коа Рисунок A 2: Мас-спектри очищеного транс-3-гексеноїл-коа, позитивний режим вгорі, негативний режим внизу Рисунок A 3: Протокол автомобільного набору 3-HB (Wako Chemicals). 132
13 Зміст IX Список скорочень 3-HB 3-Гідроксибутират AI Адекватний прийом ALA альфа-ліноленова кислота AP Лужна фосфатаза BHT Бутилгідроксилтолуол BSA Бичачий сироватковий альбумін Хол Холестерин CoA Коензим A CRIP багатий цистеїном кишковий білок d день DCIP 2,6-дихлорат дихлорид DCT 2,6-дихлор 1 (також Nramp2) DEPC діетилпірокарбонат DHA докозагексаєнова кислота DRI Дієтичний довідний прийом DTNB 5,5 -Діотіобіс (2-нітробензойна кислота) ECI Δ 3, Δ 2 -еноїл-КоА ізомераза ЕРА ейкозапентаенова кислота f коефіцієнт розбавлення FAME жирна кислота метиловий ефір FID жирна кислота -3-фосфатдегідрогеназа GC газова хроматографія GFS насичені жирні кислоти (дієта какао-масла) GL загальні ліпіди Hb гемоглобін Hk гематокрит HNF-4 печінковий ядерний фактор-4 hzip4 людський zrt-, ірт-подібний білок 4 hztl1 людський ZnT-подібний транспортер 1 ICP-AES Спектрометр з атомно-емісійною плазмою з індуктивною зв’язкою Внутрішній стандарт LM Розчинник M
14 X Зміст MFE1 Багатофункціональний фермент 1 хв хвилини MRE Елемент металевої реакції MT Metallothionein MTF1 MRE-зв'язуючий фактор транскрипції-1 MUFS поліненасичені жирні кислоти n.n. не виявляється, кількість нижче межі виявлення ns не значуща p Ймовірність помилки ПК фосфатидилхолін ПЛР ланцюгова реакція полімерази PL фосфоліпід PP проліфератор пероксисоми PPAR пероксисом проліфератор активований рецептор PPRE PPAR Елемент відповіді RDA Рекомендований дієтичний прийом RT Зворотна транскриптаза RXR SDHrogen Стандартне відхилення XHrogen Стандартне відхилення XHrogen SREBP-1 Регулюючий елемент стеролу білок-1 T a TAE TG T m TM TMSH Температура відпалу Трис-ацетат-ЕДТА-буфер Тригліцерид Температура плавлення Суха речовина N-триметилсульфоній гідроксид U Ферментативна активність (одиниця, оборот субстрату в мкмоль хв -1) Ненасичений UFS Жирні кислоти (дієта з сафлоровою олією) UL Допустимий верхній рівень споживання v об'єм див. Порівняння порівняно з вагою Zn цинк ZnT-1 транспортер цинку-1
19 Огляд літератури 5 лігандів, зв'язаних: з трьома амінокислотами (His, Glu, Asp або Cys) та молекулою води. Цинк фіксується трьома His у карбоангідразі та His-Glu-His у карбоксипептидазі (VALLEE and AULD 1990, MCCALL et al. 2000); відсутність цинку призводить до втрати каталітичної активності. Як структурний компонент, цинк тетраедрично зв’язаний з чотирма амінокислотами (Cys або His) і впливає на локальну конформацію та стабільність ферменту (рис. 1 А). AB Рисунок 1: Структури цинку (A) в металоферментах цинку, (B) в ДНК-зв'язуючих доменах факторів транскрипції (згідно з VALLEE та AULD 1992) Цинк також визначає тривимірну структуру білків цинкового пальця, кластеру цинку та цинку, що містять цинк-фактори транскрипції ( Малюнок 1 Б). Білки цинкового пальця є одними з найпоширеніших білків геному еукаріотів, які завдяки своїй тривимірній конформації можуть безпосередньо взаємодіяти з ДНК. Деякі з їх різноманітних функцій у транскрипційній регуляції все ще уточнюються (LAITY et al. 2001). Cys 2 His 2 і Cys 3 His цинкові пальці також можуть розпізнавати певні послідовності РНК за допомогою різних механізмів і зв'язуватися з ними (HALL 2005).
24 10 Огляд літератури 2.2 Регулювання експресії генів цинком Як каталітична, так і структурна, а також регуляторна функції цинку пов'язані з впливом на експресію генів (оглянуто VALLEE та FALCHUK 1993, COUSINS 1998, DREOSTI 2001). Як важливий етап транскрипції синтез РНК відбувається завдяки каталітичній активності РНК-полімераз, які як металоферменти потребують двох атомів цинку. Важливість структурної функції цинку найбільш вражаюче виявляється з мотивів цинкових пальців: петлеподібна структура пальця створюється, коли атом цинку тетраедрично укомплектований залишками цистеїнілу або гістидилу пептидного ланцюга (рис. 1 Б). Це передумова взаємодії з ДНК. Згідно з новими розрахунками, 10% людського протеома - це потенційно зв’язуючі цинк білки (ANDREINI та ін., 2006), найчисленнішим класом яких є цинкові пальці, більшість з яких виконують роль факторів транскрипції. Гени, що реагують на цинк, фізіологічна модуляція, пряма регуляція, вторинні медіатори, регульована транскрипція, регульована транскрипція, білки мрнас Рисунок 3: Можливі рівні впливу цинку на експресію генів (після COUSINS 1998)
58 44 Експериментальна частина, Огляд 14: Параметри ГХ та температурні програми для визначення діаграми FS Виявлення: паливні гази FID: H 2 (35 см3/хв) синтетичне повітря (250 см3/хв) газ для підпитки N 2 (25 см 3/хв) Автопробовідбірник: Chrompack Type 910 Ін’єкція: Розділений об’єм: 1 мкл Інкрустація: Дно скляного дзвоника Газ-носій: H 2 загальний екстракт ліпідів: Розділений потік: 25 см3/хв Попередній тиск газу-носія: 80 кПа хв елюату тригліцеридів: роздільний потік: 20 см3/хв Тиск надходження газу-носія: 60 кПа Температурна програма: 220 С 23 хв 2 Ц/хв при 230 С 230 С 35 хв. Температурна програма: 220 C 20 хв 4 C/хв до 235 C 235 C 25 хв
59 Експериментальна частина 45 Швидкість відновлення стандарту FAME регулярно перевірялася (після 2–3 зразків) і для оцінки використовували принаймні три проби ГХ на зразок. Піки, які не можна було призначити жодному FS, не були включені в аналіз. Межа кількісного визначення становила від 0,05% до 0,2% (мас./Мас.) Від загальної кількості жирних кислот, залежно від індивідуальної ФА та вмісту ліпідів у екстракті. Хроматограма стандарту FAME наведена на малюнку 7. Повні назви FAME, що містяться, наведені в додатку. Рисунок 7: ГХ-хроматограма кетонових тіл FAME-Mix C4-C у плазмі та сечі Концентрацію 3-гідроксибутирату (3-HB) у плазмі та сечі визначали за допомогою автокіту 3-HB (Wako Chemicals). Протокол детермінації наведений у додатку. Використовували 8 мкл плазми або 20 мкл сечі та для визначення порожнього значення aqua bidest. Стандарт 3-HB (Кетоновий калібратор для тіла 300) розбавляли відповідно до обсягу зразка. Концентрації 3-HB у плазмі та сечі визначали у двох примірниках у п’яти тварин на групу.