Вплив пренатального стресу на мієлінізацію та формування нейронної мережі

1 Вплив пренатального стресу на мієлінізацію та формування нейронної мережі в мозку овець плода Дисертація на здобуття вченого ступеня доктор медичних наук (доктор медичних наук), подана на розгляд Ради медичного факультету Університету Фрідріха Шиллера Джулією Кендт, яка народилася 05. Вересень 1987 року в Готі

пренатального

2 рецензенти: 1. Проф. Д-р. мед. Маттіас Шваб/Єна 2. Проф. мед. Річард Бергер/Нойвід 3. П. Д. Доктор мед. День громадської оборони Бернда Ромейке/Єни:

3 Зміст Зміст I СПИСОК СКОРОЧЕНЬ I 1 РЕЗЮМЕ 1 2 ВСТУП Клінічне значення пренатального стресу для розвитку плода головного мозку плода Ембріональний розвиток мозку Розмноження клітин та міграція Нейронні та гліальні диференціація Церебральна мієлінізація Структура та біохімічний склад Мієліну Структура мієліну Структура функції мієліну Мієлінізація Вплив пренатального стресу на розвиток головного мозку плода Церебральний вплив стресу матері Церебральний вплив пренатальної терапії глюкокортикоїдами Регулювання осі стресу Вплив стресу матері та терапії глюкокортикоїдами пренатального характеру на розвиток стресової осі Механізми впливу пренатального стресу Рецепторно-опосередковані ефекти на плід глюкокортикоїдів Пренатальний стрес та гормони росту Завдання дисертації 22

4 Зміст 3 МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ Експериментальний експериментальний протокол Екстракція головного мозку плода та підготовка зразків Гістохімічне та імуногістохімічне фарбування Огляд фарбування гематоксилін-еозином Імпрегнація сріблом за даними Бєльшовського Імуногістохімічне виявлення MBP Світло мікроскопічне та результати РЕЗ пренатальний стрес мозкові наслідки пренатального стресу формування нервових процесів у білій речовині підкіркова біла речовина мозолисте тіло глибока біла речовина корона променева капсула інтерна мієлінізація нервових процесів у білій речовині підкіркова біла речовина мозолисте тіло глибока біла речовина - корона променева капсула внутрішня формація нервових структур в Гіпокамп (регіон CA3) 64

5 Зміст 5 ОБСУЖДЕННЯ Обговорення методів тваринна модель Стресова модель Гістологія Кількісний аналіз зображень Обговорення результатів Пренатальний стрес та ріст плода Вплив після пренатального стресу на гіпокамп Церебральний вплив після пренатального стресу на нервову мережу Церебральний вплив після пренатального стресу на мієлінізацію 82 6 ВИСНОВКИ 84 7 8 ДОДАТОК Подяка Декларація про пошану 103

6 Список скорочень Список скорочень ABC ACTH ADHD AK AP AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN вісь 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Авідин-Біотин-Комплекс Адренокортикотропний гормон Розлад уваги/гіперактивність Робочий буфер антитіл Робочий буфер + Тритон-X-100 робочий буфер + Тритон + Сироватка Aqua distillata (дистильована вода) аргінін-вазопресин бетаметазон 2-3 -Ціклічний нуклеотид 3-фосфогідролаза (плацентарний) кортикотропін-вивільняючий гормон глюкокортикоїдні рецептори дні вагітності гематоксилін-еозин гіпоталамус-гіпофізар-гіпофізар Гідроксистероїддегідрогеназа типу 2 Інсуліноподібний фактор росту Мієлін-асоційований глікопротеїн Білок основи мієліну Мієлін/олігодендроцит Глікопротеїн Мінералокортикоїдний рецептор Середнє значення Олігодендроцит мієліновий білок Фосфатний буфер Швидкий рух очей Кімнатна температура Стандартна похибка середнього значення

18 2 Індукція первентрикулярної лейкомаляції (пошкодження білої речовини під час передчасних пологів) приблизно в період 0,65 гестації (що відповідає гестаційному тижні у плода людини), високий ступінь порівнянності розвитку мозку між плодовими вівцями та людьми. Це підтверджувалося тим фактом, що в цей часовий проміжок починається дозрівання олігодендроцитів у плодовому мозку овець, і в той же час високий ризик пошкодження незрілої, перивентрикулярної білої речовини може спостерігатися у недоношених дітей (Back et al. 2006, 2001) . На момент народження мозок створеної людини демонструє дещо вищий ступінь зрілості, ніж людський (McIntosh et al. 1979, Astrom 1967). Це може припустити, що творчий розум дозріває швидше в останньому триместрі. 12-й

23 2 Вступ - скоординована фізіологічна реакція на різні концентрації кортизолу (глава 2.4.2). Рис.2.3: Вісь гіпоталамус-гіпофіз-наднирники та шляхи негативного зворотного зв'язку. Гормон кортикотропіну, що вивільняє (CRH), вазопресин аргініну (AVP), проопіомеланокортин (POMC), адренокортикотропний гормон (ACTH), паравентрикулярне ядро ​​(NPV). Змінено з Metthews

30 2 Вступ показує подібний тимчасовий курс розвитку мозку для людей, навіть якщо він дозріває трохи швидше. Загалом оцінювали мозок 45 робітників, які зазнавали хронічного стресу між 0,20-0,66 гестацією (ГТ) через 180-хвилинну ізоляцію два дні на тиждень. Оскільки вівці є стадними тваринами, ізоляція є головним фактором стресу для цього виду. Для того, щоб показати можливі тривалі наслідки, мозок оцінювали на час 0,73 (110-та GT, тривалість гестації 150 днів) та 0,86 гестації (130-та GT). Результати мають на меті допомогти прояснити вплив пренатального стресу на роботу мозку в подальшому житті. 24

32 3 Матеріали та методи Ізольовано в межах чутності інших тварин, так що наприкінці протоколу кожна тварина була піддана індивідуальній ізоляції 20 разів. Оскільки вівці є стадними тваринами, вони особливо чутливі до цього стресору. Вимірювання рівня кортизолу до і під час ізоляції підтвердило цей ефект (Rakers et al. 2012). Стресова група Контрольна група Синхронізація циклу еструсу та планове спаровування ПОРІВНЯННЯ Належне розведення собак у пастуха Транспортування вагітних тварин до випробувальної лабораторії Стрес через ізоляцію 2 рази на тиждень протягом 3 год. Хронічна апаратура Отримання головного мозку плода - Група 1 Отримання плодового мозку - Група 2 Природний термін .3.1: Експериментальний протокол У період між 100-м та 110-м ОТ плоди проводили інструментарій за допомогою катетерів, які використовувались для перевірки внутрішньоутробних стресових реакцій (вивільнення АКТГ та кортизолу). Їх оцінка не є предметом цієї роботи (див. Rakers 2012). Після завершення експериментів та оперативного розвитку плодів визначали вагу їх тіла та мозку. Ці вимірювання були проведені 26

36 3 Матеріал та методи висхідної спиртової серії, зневодненої та закритої монтажним середовищем Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармштадт, Німеччина). Детальний протокол фарбування можна знайти в таблиці 3.2. Середня депарафінізація: 2x Neoclear 2x ізопропанол 100% 1x ізопропанол 80% 1x ізопропанол 50% дистильована вода. Просочення сріблом: AgNO 3 20% 2x вод. Аміачний розчин нітрату срібла дистильована вода + nh 3 (4: 1) Na тіосульфат 5% води з-під крана дистильована вода. Дегідратація: ізопропанол 50% ізопропанол 80% 2x ізопропанол 100% 2x неоклеарний бальзам з ентелановим часом [хв]/темп. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90// RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Таблиця 3.2: Протокол просочення сріблом за Бельшовським. RT кімнатна температура. Розчини готують наступним чином: 20% розчин нітрату срібла (AgNO 3): 100 мл дистильованої води; нітрат срібла; 5% тіосульфат натрію (Na 2 S 2 O 3): 100 мл дистильованої води. + 5 г тіосульфату натрію для розчину для прояву: 25 мл дистильованої води, мг лимонної кислоти (Fluka Chemie, Букс, Німеччина) + 5 мл 36% формаліну (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Німеччина) + 8 мкл концентрованої азотної кислоти HNO 3 (Fluka Chemie, Бухс, Німеччина). 30-й

40 3 Матеріал та методи 2xAP + T ABC комплекс: AP + T + розчинA + розчинB AP + T 2x PBS дистильована вода. 3'3-діамінобензидин (DAB) 2x вод. Дегідратація: ізопропанол 50% ізопропанол 80% 2x ізопропанол 100% 2x Neoclear 100% бальзам включення з Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT по 20 мкл розчину A і B в 1 мл набору AP + T 1Set (H2O2 + DAB) для 5 мл дистильованої води, фільтр з фільтром Millipore Таблиця 3.3: Протокол імуногістіохімічного виявлення MBP. Розчини готують наступним чином: Цитратний буфер: 1 літр дистильованої води. + 2,94 г цитрату натрію (Fluka Chemie, Buchs, Німеччина), рН 6,0. PBS: 1 літр дистильованої води. + 1 г робочого буфера D-PBS: 500 мл PBS + 2,5 г бичачого сироваткового альбуміну (альбумін із бичачої сироватки, мінімум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Штернхайм, Німеччина) мкл TWEEN 20 (моноолаурат поліоксиетилен сорбітану) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Штернхайм, Німеччина) ph 7.5. Розчин DAB (субстрат Sigma Fast DAB): 2 таблетки (перекис водню сечовини та 3,3-діамінобензидин) у 5 мл дистильованої води. кружляти до повного розчинення готових таблеток. 34

42 3 Матеріал та методи Рис.3.3: Оглядове фарбування H&E модифіковане, згідно з The Atlas Brain Atlas, Банк біорізноманіття мозку Університету штату Мічиган, Національний науковий фонд Зліва: Підкіркова біла речовина у фронтальній корі: біля кори [1] та віддалена від кори [2]; Мозолисте тіло [3]; Corona radiata [4]; Внутрішня капсула [5]; SV: бічний шлуночок. Праворуч: область CA3 в гіпокампі: черевний відділ [1], спинний відділ [2] 36

43 3 Матеріал та методи Після цифрового зберігання записи оцінювались у програмі обробки зображень (Scion Image 1.62 NIH, США). Спочатку кольорові зображення були перетворені в чорно-білі зображення з 256 рівнями сірого. Площа позитивного маркування в межах репрезентативного зрізу визначалася за допомогою аналізу зображень. Площа просочення імуноміткою/сріблом відображає імуногістохімічний розподіл антигену/щільність клітинних процесів. Порівняно з мікроскопічним зображенням, верхнє та нижнє порогові значення встановлювали під візуальним контролем. Ці порогові значення утворюють діапазон для селективного представлення позитивної імунореактивності MBP або нервових волокон срібного кольору. (див. рис. 3.4, червоне маркування). Рис. 3.4: Аналіз зображення за допомогою значень сірого A: Мікроскопічне зображення: Нейронні процеси в підкірковій білій речовині лобової кори, віддаленої від кори. 37

44 3 Матеріал і методи B: Позначення забарвлених розширень клітин на сірому зображенні Порівняно з мікроскопічним зображенням на сірому зображенні визначена сіра зона (позначена червоним на зображенні), що відповідає позитивному сигналу просочення сріблом. Ця площа вимірюється програмою аналізу зображень. 38

61 Площа MBP-IR [10-3 мм²] 4 результати Підкіркова біла речовина - біля кори 1.00 0.50 $$$ $$$ (n = 9) (n = 11) Контрольний стрес (n = 15) (n = 10) 0, термін вагітності [d] Рис. 4.18: Вплив віку та стресу на мієлінізацію нейрональних процесів у підкірковій білій речовині лобової кори поблизу кори. МВт ± SEM. $$$ p 62 4 Результати Тіла клітин та нервові відростки в підкірковій білій речовині, віддаленій від кори, чітко позначені як MBP-позитивні (рис. 4.19). Рис. 4.19: Мікрофотографії нервових процесів у підкірковій білій речовині лобової кори, віддаленої від кори. Імуногістохімічне виявлення MBP. Тіло клітини нейронального процесу A: контрольна тварина в день гестації 110 B: тварина в стресі в день гестації 110 C: контрольна тварина в день гестації 130 D: тварина в стресі в день гестації 130

72 Площа просочення сріблом [10-3 мм²] 4 результати 1,50 Гіпокамп- область CA 3, черевна ділянка 1,00 $ 0,50 (n = 9) (n = 7) (n = 6) * (n = 8 ) Контрольний стрес 0, термін вагітності [d] Рис. 4.29: Вплив віку та стресу на нейронну мережу в області CA3 гіпокампу, черевний відділ. МВт ± SEM; * p 73 4 Результати Рис. 4.30: Мікрофотографії нейрональної структури в області CA3 гіпокампу, тильний відділ. Просочення сріблом. Клітина з ядром Нейрональний процес A: контрольна тварина в день гестації 110 B: тварина в стресовому стані в день гестації 110 C: контрольна тварина в 130 день гестації D: тварина в стресі в день гестації 130