Вплив тканинних макрофагів на хвороби метаболізму - PDF Безкоштовно завантажити
1 Вплив тканинних макрофагів на хвороби метаболізму МАГІСТЕРСЬКА ТЕЗА для здобуття вченого ступеня магістра наук в Гамбурзькому університеті прикладних наук Факультет наук про життя Департамент біотехнології проф. Олівер Ульріх доктор Андре Броерманн подав: Крістіан Дікель, вівторок, 13 листопада 2012 р
2 Гамбургський університет прикладних наук Факультет наук про життя Департамент біотехнологій Lohbrügger Kirchstrasse Hamburg у співпраці з: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. Олівер Ульріх доктор Андре Броерманн
3 Зміст 1. Вступ. VI 1.1 Ожиріння та резистентність до інсуліну. VI 1.2 Еволюційна перспектива. VIII 1.3 Макрофаги при метаболічних захворюваннях. X підтипи макрофагів. X Трансендотеліальна міграція макрофагів. XIII Роль CCR2 та MCP-1 у вербуванні макрофагів. XIII 1.4 Маркери лейкоцитів для аналізу FACS. XV 1.5 моделі тварин. XVI Об/об миша. XVI Миша db/db. Миша XVII DIO. XVII 1.6 Варіанти лікування діабету II типу. XVIII 1.7 Завдання. XXII 2. Матеріали та методи. XXIII 2.1 Матеріали. XXIII Витратні матеріали. XXIII Використане обладнання. XXIII хімікати. XXIV антитіла. XXVI кормові суміші для тварин. XXVI 2.2 Методи. XXVII підготовка тканини. XXVII ізоляція клітин. Кількість клітин XXVII. XXVII імунофлуоресцентне фарбування. XXVIII Аналіз сортувальника клітин, що активується флуоресценцією (FACS). XXIX III
4 2.2.6 Оцінка. XXX тест на толерантність до інсуліну (ITT). XXXI тест на пероральну толерантність до глюкози (ogtt). XXXII аналіз цитокінів. XXXII тварини. Статистика XXXIII. XXXIII 3. Результати. XXXIV 3.1 Встановлення стратегії обробки жирової тканини епідидимової миші для аналізу FACS банкоматів. XXXIV 3.2 Встановлення методу FACS для кількісного аналізу лейкоцитів. Тандемна панель XXXV (панель на 4 особи). Аналізи XXXV з 3-кратним фарбуванням. XXXVI комбінована панель (панель з 4). Тест системи XLI 3.3. Лейкоцити XLIV у генетичній моделі діабету. Порівняння методів XLIV. Аналіз XLIV з 3 панелями. Аналіз XLVII за допомогою комбінованої панелі. Порівняння результатів LI. Лейкоцити LII в індукованій дієтою моделі діабету. LIII 3.4 Субхронічне дослідження антагоніста CCR2 у мишей huccr2. Лейкоцити LVI. LVI концентрація MCP-1 у плазмі крові. Метаболічні параметри LXII. LXIII 4. Обговорення. LXV 4.1 Створення аналізу FACS для кількісної оцінки загальних та прозапальних макрофагів у жировій тканині миші. Тандемна панель LXV. Комбінована панель LXV. LXV потрійне фарбування. Панель LXVI M1/M2. LXVI IV
5 4.2 Порівняння методів. LXVII 4.3 Генетичні моделі миші. LXVIII 4.4 Модель ожиріння, спричиненого дієтою (DIO). LXX 4.5 Порівняння моделей ожиріння. LXXI 4.6 Збільшення кількості банкоматів у мишей із ожирінням. LXXII 4.7 Антагонізм CCR2 як терапевтичний варіант лікування діабету II типу. Номери банкоматів LXXIII перед обробкою речовин. LXXIII Протизапальний ефект піоглітазону в моделі DIO. Антагонізм LXXIV CCR2 без протизапальної дії на жирову тканину яєчка. LXXIV Зв'язок між запаленням жирової тканини та метаболічними параметрами в цьому експерименті. LXXV 5. Перспектива. LXXVI 6. Резюме. LXXVII 7. Список скорочень. LXXVIII 8. Список малюнків. LXXXI 9. Перелік таблиць. LXXXIV 10. Бібліографія. LXXXV 11. Додаток. LXXXIX 11.1 Технічні паспорти для кормових сумішей. LXXXIX паспорт даних фермерського корму. LXXXIX опис дієти з високим вмістом жиру. XC паспорт нормальної дієти. XCI 11.2 FACS протокол Dr. Чавакі в ТУ Дрезден. Свідчення XCII. XCVII дякую. XCVIII V
9 1. Вступ Рисунок 2: Еволюція жирової тканини, печінки та системи кровотворення в окремих органах ссавців У Drosophila melanogaster жирова тканина, печінка та система кровотворення об’єднані у функціональну одиницю, яка називається жировим тілом. Це походження розвитку відображається у подібній структурі гомологів ссавців. Вплив адипоцитів у жировій тканині та гепатоцитах у печінці на відповідні імунні клітини, макрофаги та клітини Купфера дуже схожі. Крім того, існує тісний зв’язок між імунною системою та реакціями метаболічної системи, що відображається у безпосередньому доступі двох тканин до мережі кровоносних судин. (Hotamisligil, 2006) 9
10 1. Вступ 1.3 Макрофаги при метаболічних захворюваннях Підтипи макрофагів У 2003 р. Вперше було опубліковано зв’язок між ожирінням, пов'язаною з резистентністю до інсуліну, та хронічним запаленням у жировій тканині, що виражалося у вигляді скупчення макрофагів у білій жировій тканині (Weisberg et al., 2003; Xu et al., 2003). Макрофаги - це диференційовані моноцити, які розвиваються з клітин-попередників спинного мозку. Тому вони належать до циркулюючих білих кров'яних клітин. Як моноцити, так і макрофаги є гетерогенними популяціями клітин. Спочатку було визначено два підтипи макрофагів: класично активовані прозапальні макрофаги M1 та альтернативно активовані макрофаги M2 (Gutierrez et al., 2009; Schipper et al., 2010). У ссавців нормальної ваги лейкоцити містяться в жировій тканині, печінці, м’язах і підшлунковій залозі. Їх фенотип відповідає макрофагам М2, які беруть участь у тканинному гомеостазі (Lumeng et al., 2007c; Lumeng et al., 2008; Odegaard et al., 2008; Olefsky & Glass, 2010; Lumeng et al., 2007b). При цьому вони виділяють протизапальні цитокіни, такі як інтерлейкін (IL) -10, IL-4 та IL-13 (рис. 3). 10
11 1. Вступ Рисунок 3: Поляризація макрофагів при індукованій ожирінням резистентності до інсуліну в жировій тканині За умов нормальної ваги адипоцити виділяють такі фактори, як інтерлейкін (ІЛ) -13, що викликає альтернативну активацію макрофагів. Альтернативно активовані (М2) макрофаги виділяють протизапальні медіатори, такі як IL-10. Ці протизапальні цитокіни позитивно впливають на чутливість до інсуліну. Ожиріння індукує зміни метаболізму адипоцитів та експресії генів цитокінів. Це призводить до посиленого ліполізу та вивільнення прозапальних вільних жирних кислот (ffas) та факторів, які залучають та активують макрофаги. Такими факторами є хемотаксичний білок-1 моноцитів (MCP-1) та фактор некрозу пухлини α (TNFα). Класично активовані макрофаги M1 виробляють велику кількість прозапальних медіаторів, таких як TNFα, IL-1β та резистин, які діють на адипоцити і, таким чином, індукують резистентність до інсуліну. Таким чином встановлюється самозміцнювальне замкнуте коло, яке ще більше збільшує запалення та резистентність до інсуліну. (Olefsky & Glass, 2010; Рисунок 2, с. 223) 11
23 2. Матеріали та методи 2. Матеріали та методи 2.1 Матеріали Витратні матеріали Опис Виробник № товару №. Рукавички нітрилові Kimberly-Clark # 90627 Мікрореакційні пробірки eppendorf # Трубки безпечного замка (0,5, 1,5, 2,0 мл) eppendorf # eppendorf # наконечники для піпеток eppendorf # (20, 200, 1000, 5000 мкл) eppendorf # eppendorf # eppendorf # Матричні наконечники піпеток Thermo Scientific # 7281 Одноразові піпетки резервуар для реагенту costar VWR # Пробірка для центрифуги (15, 50 мл) грейнер # 188271, пробірки для мл BD Falcon # лунка з глибоким круглим дном BD Falcon # Petri Dish BD Falcon # Одноразові камери для підрахунку клітин тест на глюкозу крові # 10283 Zellstrayner Fisherbrand # Використовувані пристрої Позначення Назва продукту Виробник Аналітичні ваги AC211S Ваги Сарторія A30 Інкубатор Mettler BBD 6220 Heraeus нахил шейкер PTR-30 Грант-біо Холодильна центрифуга Heraeus Megafuge 40R Thermo Scientific піпетки 2, 10, 20, 100, 200, 1000, 5000 orf
24 2. Матеріали та методи Матричні піпетки 1250 Matrix Impact 2 Thermo Scientific допоміжний прилад для піпетування аккумуляторний БРЕНД шафи безпеки Hera Safe Thermo Scientific настільна центрифуга 5417C eppendorf Vortexer VF2 Janke & Kunkel лічильник клітин Графиня некротичний Флуоресценція активований сортувальник клітин MACS Quant Miltenyi Biotech 4000 MSD AGM Назва хімікатів Cobas Integra 400 plus Roche Bacillol plus Виробник № продукту. BODE RPMI 1640 з глютаміном Лонза # 4464 Фетальна бичача сироватка Біологічна промисловість # 04-001AUS-1A Dulbecco s Phophate Buffered Saline Lonza # 6716 Collagenase Sigma # C0130 Trypan blue invitrogen # T10282 Running Buffer MACS Buffer # Buffer Solution MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Buffer Solution MACS MACS Розчин для відбілювання MACS Буфер # амонію хлорид EDTA Sgima AG Sigma #EG калію гідрогенкарбонат натрію хлорид MERCK # хлорид калію MERCK # динатрію гідрофосфат MERCK # магнію сульфат MERCK #
25 2. Матеріали та методи Хлорид кальцію Sigma #CG Калій дигідроген гідрофосфат MERCK # Hepes Fluka # 54466 Гідрокарбонат натрію MERCK # Глюкоза Sigma-Aldrich # 15,896-8 Антагоніст піоглітазону CCR2 Такеда внутрішньо продукований буфер гемолізу 150COCOC 4 Cl 250 µH ED: Розчин 1 (4-кратний) 137 мм NaCl 5,36 мм KCl 0,34 мм Na2HPO4 0,81 мм MgSO4 1,26 мм CaCl2 0,44 мм KH2HPO4 Розчин 2 (4-кратний) 10 мм Гепес 4,17 мм NaHCO3 Змішайте 1 частину розчину 1 та 2 з 2 частинами подвійної дистильованої води та доводьте рН до 7,3 за допомогою NaOH при температурі розчину 4 ° C. 25-й
26 2. Матеріали та методи Антитіла Позначення Виробник № товару №. PE Щур Anti-Mouse CD45 BD Pharmingen # PE Щур IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # APC Щур Anti-Mouse CD11b BD Pharmingen # APC Щур IgG2b, κ Isotype Control BD Pharmingen # PE-Cy 7 Хом'як Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE-Cy 7 Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # PE Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # PE Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # FITC Hamster Anti-Mouse CD11c BD Pharmingen # FITC Hamster IgG1, λ1 Isotype Control BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Щурячий анти-миша CD45 BD Pharmingen # Alexa Fluor 700 Щурячий IgG2b, κ Ізотип контролю BD Pharmingen # Щурячий анти-мишачий F4/80 Антиген: FITC Щурячий IgG2b Негативний контроль: FITC AbDserotec # MCA497FB abdserotec # MCA1125FT -Миша CD16/CD32 BD Pharmingen # Суміші кормів для тварин Зберігання корму Kliba Nafag #% ккал дієта з високим вмістом жиру Дослідницькі дієти # D% ккал Контрольна дієта Дослідні дієти # D12450B Відповідні паспортні дані для кормових сумішей можна знайти в додатку (розділ 11.1). 26-й
31 2. Матеріали та методи Розрахунок концентрації банкоматів у жировій тканині: Розрахунок відсотка макрофагів у SVF: Тест на толерантність до інсуліну (ITT) Тест на толерантність до інсуліну (ITT) також називають тестом на інсулінову гіпоглікемію і використовується для виявлення резистентності до інсуліну. Після ін’єкції інсуліну спостерігається значне зниження концентрації цукру в крові у здоровому організмі. Якщо є резистентність до інсуліну, зниження рівня глюкози у крові у відповідь на введення інсуліну зменшується. Тварини голодують за дві години до початку експерименту. Через ці дві години, безпосередньо перед застосуванням інсуліну, приймається значення голодування. Розчин інсуліну дають тваринам внутрішньовенно. застосовується (наприклад, 0,5 МО/кг). Часом через 10, 20 та 120 хвилин після введення інсуліну рівень цукру в крові тварин вимірюють за допомогою смужок для вимірювання цукру в крові та вимірювального приладу від Gluko Smart Swing. Це робиться за допомогою капілярної крові з кінчика хвоста. 31
33 2. Матеріали та методи Тварини Всі експерименти на тваринах проводились відповідно до рекомендацій Тюбінгенської регіональної ради. Мишей розміщували в середовищі, вільному від патогенів, за стандартного світлового циклу (12 годин світло/темрява) із вільним доступом до води та їжі. Тварин замовили у Янв’єра. У цьому проекті була використана дієта з високим вмістом жиру для стимулювання інсулінорезистентності. Для цього мишам C57BL/6J давали дієту D12451 (20% ккал білка, 35% ккал вуглеводів, 45% ккал жиру) та відповідну контрольну дієту D12450B (20% ккал білка, 70% ккал вуглеводів, 10% ккал жиру) з Research Diets з такою ж кількістю ккал у загальній статистиці Статистичний аналіз проводився за допомогою програми Prism Версії 5.0 для Windows від Graphpad. За допомогою t-критерію порівнювали дві групи. Для групового аналізу з більш ніж двома групами аналіз проводили за допомогою тесту ANOVA та Даннета. Значення р 0,05 вважали значущими. Значимість була позначена наступним чином: * відповідає р 0,05, ** відповідає р 0,01 і *** відповідає р 0,
37 3. Результати A B C Рисунок 8: Контроль ізотипу панелі макрофагів з щурами κ-pe щура, IgG2b-FITC щура та κ-apc щура IgG2b A У крапковому блокуванні SSC проти FSC визначається затвор P1 (червоний), який показує SVF. B PE та FITC-сигнали від цього затвора P1 додатково аналізуються в точковому блоті. Виразну популяцію, яка є позитивною для обох міток, позначають як CD45 + F4/80 + (зелений). C Ці подвійні позитивні клітини нанесені на гістограму проти їх сигналу APC, а позитивний сигнал (рожевий) зображує потрійні позитивні макрофаги SVF. Визначено конкретну популяцію клітин CD45 + F4/80 + (ФІГ. 7B). Подвійні позитивні клітини досліджуються в каналі APC для специфічного позитивного сигналу CD11b (фіг. 7С). Ці потрійно-позитивні клітини є макрофагами. Відповідний контроль ізотипу показує, як очікувалося, лише дуже низький неспецифічний сигнал як для крапкової крапки PE/FITC (фіг. 8B), так і для гістограми APC (фіг. 8C). 37
39 3. Результати ABCD Рисунок 10: Контроль ізотипу провоспалювальної макрофагальної панелі з щурячим IgG2b κ-PE, щурячим IgG2b κ-apc та Hamster IgG1 λ1-fitc A. карти. B Сигнал PE цього затвора P1 додатково аналізується в точковому блоті. Позитивні клітини CD45 (сині) закриті, а С показано на гістограмі проти їх сигналу APC. Позитивний сигнал (рожевий) потім виводиться D відносно сигналу FITC. Таким чином можна проаналізувати потрійно-позитивні прозапальні макрофаги SVF (зелений). Сигнал PE антитіла проти cd45 показує дві хмари точок, які можна чітко відрізнити один від одного (рис. 9B). Два чітко визначені піки також можна побачити на гістограмі APC (рис. 9C). У контролі ізотипу немає жодних неспецифічних прив'язок ні в одному каналі (ФІГ. 10B і 10C). Однак подвійні позитивні комірки демонструють високий фоновий шум для випромінювання флуоресценції в каналі FITC (фіг. 9D). Однак усі неспецифічні сигнали можуть бути виключені через встановлений затвор (рис. 10D). 39
41 3. Результати Клітини F4/80 + CD11b + утворюють окрему популяцію клітин на діаграмі FITC/APC (ФІГ. 11B). Ці подвійні позитивні макрофаги також утворюють негативний та позитивний сигнал у гістограмі PE (фіг. 11C). Як у воротах макрофагів, так і в закритих клітинах CD11c + призначені для контролю ізотипу без сигналу (рис. 12B і 12C). Комбінована панель (панель з 4). Оскільки аналіз чотирьох клітинних маркерів в панелі антитіл має великі переваги, такі як менша витрата антитіл і менший час, ніж при аналіз двох 3-кратного фарбування макрофага та прозапальної панелі макрофагів означає, що панель з F4/80-FITC, CD11b-APC та CD11c-PE була розширена анти-CD45 антитілом з міткою Alexa Fluor 700. 13 показує спектр випромінювання чотирьох використовуваних міток. Поєднання цих фторхромів повинно бути можливим, оскільки спектри випромінювання не перекриваються в своїх максимумах. Рисунок 13: Спектри флуоресценції комбінованої панелі (панель з 4) з FITC, PE, APC та Alexa Fluor700 41
42 3. Результати Отримана структура стробування для аналізу макрофагів та прозапальних макрофагів показана нижче (рис. 14). Відповідний контроль ізотипу можна побачити на рис. 15. A B C D Рисунок 14: Вентилі 4-смугової панелі антитіл із CD45-Alexa700, F4/80-FITC, CD11b-APC та CD11c-PE A У крапковому пятні SSC проти FSC визначається затвор P1 (червоний), який представляє SVF. B Сигнали Alexa Fluor700 та FITC від цього ворота P1 додатково аналізуються в точковому блоті. Виразну популяцію, яка є позитивною для обох міток, позначають як CD45 + F4/80 + (синій). Ці подвійні позитивні клітини побудовані на графіку щодо їх сигналу APC в С на гістограмі, а позитивний сигнал (рожевий) являє собою потрійно позитивні макрофаги SVF. Позитивні прозапальні макрофаги CD11c SVF, зафіксованого через зелені ворота, можуть бути пов'язані безпосередньо з макрофагами SVF того самого зразка в одному вимірі. 42