Аналіз витоку на основі протеоліпосом для визначення одномолекулярних властивостей Cl-каналів та

200 футів акредитивів, які будуть додані до камери запису на кроці 6.5.

6. Вимірювання потоку

1. Помістіть 2 мл 100 мМ KCl у еталонну (масову) камеру та 1,8 мл зовнішнього буфера (1 мМ KCl, 150 мМ K 2 SO 4, 25 мМ лимонної кислоти при рН 4,5) у камеру реєстрації. Незначний осмотичний дисбаланс між внутрішніми та зовнішніми розчинами не впливає
2. Запустіть програму придбання. Нехай базовий баланс, це може зайняти кілька хвилин.
3. Як тільки сигнал досягне стабільного базового рівня (ліпосоми готові, а колонки висохнуть), почніть запис (малюнок 3А).
4. Додайте 15 мкл 10 мМ розчину KCl для калібрування системи (малюнок 2А).
5. Додайте ліпосоми. Невеликий стрибок може бути помітний через неповне видалення зовнішніх Cl - протеоліпосом (малюнок 3А). Зачекайте, поки базовий рівень стабілізується.
6. Додайте валіноміцину (1 мкл при 1 мг/мл в EtOH), щоб ініціювати витікання (малюнок 3A).
7. Нехай витік стежить за своїм розвитком з плином часу, поки не стане плато (малюнок 3A).
8. Додайте 40 мкл 1,5 М β-октилглюкозиду (β-OG), приготовленого у зовнішньому буфері, для розчинення всіх ліпосом (малюнок 3А). Повна реєстрація.

7. Аналіз даних

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

1/3 містить ліпосом 0 активних білків. З цих значень ми обчислюємо, що одиницею транспортної швидкості є γ

2500 Cl - сек -1, що добре узгоджується з опублікованими значеннями 8.14.

Рисунок 2: Налаштування запису (A) Запис поміщений місце . (Б) Закри спалень. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 3: Зразок і аналіз (A) Типовий V (t) слідів експериментів з викидом протеоліпосом, відновлених WT CLC-ec1 при 0,2 пг/мг Р/L. Стрілки вказують час додавання калібрувального імпульсу KCl, ліпосом, валіноміцину та β-OG. Пунктирними лініями позначені значення AV на різних етапах. (B) V (t) перетворюється на слід Cl (t) за допомогою рівняння 5, нормується за допомогою рівняння 6, а час потоку відповідає рівнянню 7 (пунктирна червона лінія). (VS) нормалізований протягом курсу витік протеоліпосом, відновлених WT CLC-ec1 при 0,2 мкг/мг P/L (чорний) або при 5 мкг/мг P/L (сірий). Пунктирна лінія найкраще відповідає курсам часу потоку до рівняння 7.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Ми описали детальний протокол для вимірювання Cl-опосередкованого транспорту відновленими каналами або транспортерами в очищених селективних аніонних ліпосомах. В якості прикладу був використаний обмінник прокаріот H +/Cl - CLC-CE1. Однак метод може бути легко адаптований для вивчення каналів, керованих лігандами 12,13,15,11,12 напруги, або різної спортивної аніонної селективності 15,16, замінивши Ag: AgCl таким, який підходить для іона. . Електроди, селективні для іонів, відмінних від Cl -, таких як H +, I - і F -, є комерційно доступними.

Обговорення деяких важливих кроків та припущень, яких слід дотримуватися.

Межі розведення Пуассона

Виведення одиничної норми (рівняння 7-9) справедливе лише при дієті розведення Пуассона, коли більшість ліпосом дотримуються лише одного активного білка, тому ймовірність наявності кількох копій у даному міхурі низька, а макроскопічна постійна часу потоку Популяція пухирців добре наближена до кількості ліпосом, що містять один білок. Дійсно, порівняння курсу Cl часу потоку, опосередкованого відновленими ліпосомами, з SIC-ec1 при низькому (чорний, 0,2 пг/мг) і високому P/L (сірий, 5 мкг/мг) (малюнок 3C) показує, що в останньому випадку кінетика витоку стає швидшою і f 0 зменшується, що вказує на те, що менша частка всіх ліпосом містить 0 білків. Загальна кількість Cl, що міститься у двох зразках везикул, була порівнянна,

0,55 мкмоль відповідно, що вказує на те, що загальний внутрішній об’єм везикул у двох зразках був подібним і що кількість відновленого білка не впливала на розмір везикул. Пристосування/L високого витікання часу до рівняння 7 дає значення τ; (5 мкг/мг) = 8,8 с і f 0 (5 мкг/мг) = 0,06, що вказує лише на це

6% везикул не містять активних димерів CTC-EC1, на відміну від

31% виявлено, коли P/L = 0,2 нг/мг. Таким чином, оцінка коефіцієнта обороту одиниці при високому P/L дорівнює γ

450 Cl - сек -1, майже в 6 разів нижчий, ніж отриманий при низькому P/L та опублікованих даних 8,14. Отже, аналіз потоку відновлених ліпосом із високим рівнем вмісту/часу з часом призведе до недооцінки одиничної швидкості транспорту відновленого білка. Таким чином, для точного визначення одиничної швидкості транспортування нового білка, надзвичайно важливо точно визначити кількість відновленого білка та працювати при низьких рівнях вмісту/вмісту, в режимі розведення Пуассона. Це в ідеалі досягається шляхом визначення повного аналізу білка для визначення оптимальної дієти для роботи.

Визначення маси активного комплексу

спроби "> Аналіз, описаний вище, передбачає, що стехіометрія активного комплексу відома, а відновлений білок повністю активний. Однак нові препарати для цих кількостей можуть бути невідомі апріорі. У цьому випадку можна безпосередньо визначити ці параметри шляхом вимірювання білка f 0 при різних співвідношеннях ліпідів

де p - щільність білка, Ρ - кількість ліпосом на масу ліпідів, N A - число Авогадро, P M - маса комплексу функціональних каналів і φ - частка активних білків. Пристосовуючи експериментально визначені f 0 до різних білків на рівні ліпідів, можна визначити p 0, а отже, M P і φ.

Фракція готових ліпосом вогнетривка до включення

Виведення одиничної швидкості транспорту припускає, що при високому P/всі L ліпосоми будуть містити принаймні один активний транспортний білок. Однак у деяких випадках було встановлено, що це не так: при високому P/значна частка L 'ліпосом залишається рефрактерною до відновлення певних білків 11-13,17. Незважаючи на те, що походження цього явища не є ясним, можливо, більші білки можуть бути виключені з везикул з меншими радіусами, що зменшує кількість доступних ліпосом.

У цьому випадку рівняння 10 слід змінити так:

де θ - частка ліпосом, тугоплавких до включення білка. Важливо, що на ρ і φ також впливає метод відновлення, оскільки різні процедури матимуть різне відновлення ліпідів та білків під час відновлення та формування ліпосом. Якщо припустити, що 100% врожайність для них призведе до поганої оцінки γ. Тому для отримання точної кількісної оцінки одиниці обертання/провідності важливо експериментально визначити частку ліпідів та білків під час відновлення втрачених 8,11.

Орієнтація відновлених білків

Міркування щодо утворення щільних ліпосом

Узагальнення на канали та носії типу CTC

Аналіз потоку, як описано тут, може бути безпосередньо використаний для визначення властивостей окремих молекул будь-якого Cl-селективного каналу або транспортера, і, наприклад, був використаний для характеристики властивостей активованого Cl Ca 2+ - каналу 12 TMEM16A . Зараз ми обговорюємо, як адаптувати аналіз витоку для дослідження властивостей транспортерів або каналів, які не є Cl-селективними та/або одиничними швидкостями транспорту, які значно відрізняються від 10.

3 сек -1 іонів CLC-CE1.

1-2 секунди), а власний час відгуку реєструючого електрода стане обмежуючим швидкість. У цьому випадку кінетична інформація втрачається, але масу активного комплексу все одно можна визначити 24. Слід зазначити, що інші підходи, такі як площинні записи ліпідного двошару або ліпосоми затискачів, є більш придатними для дослідження очищених іонних каналів оскільки ці методи безпосередньо надають інформацію про одну молекулу з високою тимчасовою роздільною здатністю.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.