Аналізи in vitro та in vivo антиканцерогенної активності куркуміну та децетену куркумін am
З області генетики людини, теоретичної медицини та біологічних наук або клінічної медицини медичного факультету Університету Саар, Хомбург/Саар In vitro та in vivo аналізи антиканцерогенної активності куркуміну та кукуміну децетусу на злоякісну меланому миші Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора Медичний факультет природничих наук УНІВЕРСИТЕТ ДЕ СААРЛАНД 2014 подано: Індра Навіна Дамке народилася: 1 грудня 1979 р. В Кобленці
День підвищення: декан: проф. Доктор медичних наук Менгер 1-й доповідач: проф. Д-р E. Meese 2-й доповідач: PD Dr. M.W. Лашке
На згадку про мого батька, який познайомив мене з наукою
Зміст I Зміст 1. Короткий зміст. 1 2. Вступ. 5 2.1. Злоякісна меланома. 5 2.2. Куркумін. 6 2.2.1. Хімічні властивості куркуміну. 9 2.2.2. Фармакокінетика куркуміну. 10 2.2.3. Фармакокінетика куркуміну у людини. 11 2.2.4. Покращення біодоступності. 11 2.2.5. Токсичність. 12 2.2.6. Фармакодинаміка куркуміну у людини. 12 2.2.7. Молекулярні мішені куркуміну. 13 2.3. МіРНК. 15 2.4. Власне запитання. 18 3. Матеріал і методи. 19 3.1. Лабораторне приладдя. 19 3.2. Клітинні біологічні методи. 19 3.2.1. Використовувані клітинні лінії. 19 3.2.2. Культивування клітин. 19 3.2.3. Виділення первинних периферичних мононуклеарних клітин людини. 20 3.2.4. Кількість клітин. 21 3.2.5. Аналіз WST-1. 22 3.2.6. Проточний цитометричний аналіз. 22 3.2.6.1. Визначення цитотоксичності. 24 3.2.6.2. Визначення фаз клітинного циклу. 25 3.2.7. Флуоресцентний мікроскопічний аналіз. 25 3.3. Молекулярно-біологічні методи. 26 3.3.1. Виділення РНК із зразків пухлини. 26 3.3.2. Аналіз високої пропускної здатності профілю mirna. 27 3.3.3. In silico аналіз клітинних сигнальних шляхів. 29 3.3.4. Кількісна ПЛР у реальному часі від mirnas. 29 3.3.4.1. Зворотна транскрипція. 29 3.3.4.2. Кількісна ПЛР у реальному часі (qrt-pcr). 30-й
Зміст III 4.2.2. Проліферація та апоптоз у моделі дорсальної шкірної камери. 58 4.2.3. Зростання пухлини та неоангіогенез у моделі пухлини флангу. 58 4.2.4. Експресія NF-κB у пухлинах флангу. 60 4.2.5. Профіль МіРНК пухлин флангу. 60 4.2.6. Вираження відповідних мірн в клітинних лініях меланоми. 64 4.2.7. Сигналізаційні шляхи, що регулюються результативно. 65 4.2.8. Цілі «Мирна-205-5п». 66 5. Обговорення. 68 5.1. Вплив піролітичних процесів на куркумін. 68 5.2. Вплив дієтичного куркуміну на меланому. 71 5.3. Висновок та перспективи. 79 6. Бібліографія. 81 7. Подяки. 94 8. CV. 95 9. Публікації. 96 10. Додаток. 97
Список скорочень IV Список скорочень Рис. Рисунок Akt протеїнкіназа Akt, протеїнкіназа B al. alii APC Аллофікоціанін APS амоній персульфат Bcl-2 B-клітинна лімфома 2 BDMC Бідеметоксикуркумін bp basepare BRAF v-raf мишача саркома вірусний онкоген гомолог B1, серин/треонінпротеїн кіназа B-Raf C вуглець Ca кальцій CDd кластер дициференції цикліну C дицинація C кальцію CD кластерину дициференції комплект тирозинкінази КІТ Cl хлорид c-myc myc мієлоцитоматоз вірусний онкоген гомологічний ЦОГ-2 циклооксигеназа 2 CTLA-4 цитотоксичний антиген Т-лімфоцитів 4 Cur, CUR куркумін редист. бидистиллированной DEPC діетілпірокарбонатом DHC dihydrocurcumin ДКС decetene куркумін DMC demethoxycurcumin ДМСО demethylsulfoxide ДНК deoxyribonuleic кислота дНТФ деоксірібонуклеозід трифосфат ДТТИ дітіотреїтолу дУТФ 2-дезоксіурідіна епізод ефективного Епіфіти 2-дезоксіурідіна перехід 1-пол-epiphosphate, ранній перехід mesoxyuridine, 5-к-1-трифосфат концентрації білка 50, transymptive половина ефективний epiphosphate, 5-к-1 бісфосфат концентрація білка 50, transymptymium половини-1-трифосфат білок 50 HER, EGFR рецептор епідермального фактора росту людини/еритробластичний лейкоз вірусний онкоген гомологічний ESR1 рецептор естрогену альфа FACS флуоресценція, активоване сортування клітин FDA Управління харчовими продуктами та ліками g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2
Список абревіатур V GFP зелений флуоресцентний білок Н водень год. Година Гепес 2- [4- (2-гідроксиетил) піперазин-1-іл] етансульфонова кислота HIF-1α Гіпоксія-індукований фактор-1альфа hsa Homo sapiens ICAM-1 міжклітинний адгезивний білок-1, CD54 IgG імуноглобулін G ip внутрішньочеревна IRAK1 інтерлейкін-1-асоційована з рецептором кіназа 1 в/в. внутрішньовенне внутрішньовенне введення внутрішньожиттєвої флуоресцентної мікроскопії IκB інгібітор каппа B кда кідальтон KEGG Кіотська енциклопедія генів і геномів кг кілограмів маси тіла M 1 G малондіальдегід-ДНК ма міліампер Ме метилова група мкг мікрограм мкл мікролітрів мкм мікрометрів мікрон мікрон мікрон мікрон мікрон мікрон мкг мікрон мікрон мікрон мікрон міг мкг мін мгм мікрон мікрон мкг міг мкг мін мгм мін мкг мін мгм мікрон мкг мін мгм мкм мін мгм мкм мін мгм мкм мгм мнм мкм мкм мнм міліграмм мкг мкг мнм мкм міліграмм мкг мілімітрій мг м. м. м. м. мг. м. мг. індукований mirna комплекс мовчазного комплексу середнє середнє мл мілілітрів мм міліметрів mmu Mus musculus mol Mol mrna messengerrna mtor ссавець мішень рапаміцину (серин/треонін протеїнкіназа) n число Na натрій NF-κB ядерний фактор-каппа бета нг нанограмм нм нанометр O атом кисню ORA аналіз надмірного представництва
Список скорочень VI p53 пухлинний білок 53 PAGE електрофорез у поліакриламідному гелі PBS, забуференний сольовим розчином сольовий розчин PCAF P300/CBP-асоційований фактор PCNA проліферуючий клітинний ядерний антиген PCR полімеразна ланцюгова реакція PECAM, CD31 молекула адгезії ендотеліальних клітин тромбоцитів PI пропідій йодид p. o. per os PPAR-γ активований проліфератором пероксизоми рецептор-γ PTEN фосфатаза і тензин гомолог PYR піролізний куркумін qrt-pcr кількісна ланцюгова реакція полімерази в реальному часі РНК синтез рибонуклеїнової кислоти див. білок 1 фактор транскрипції Src Тирозинкіназа Src (саркома) T добу t тон TBS-T Буферний сольовий розчин і Tween 20 TE Трис-EDTA буфер TNF-α Фактор некрозу пухлини-альфа TPA 12-O-Тетрадеканоїлфорбол-13-ацетат Tris 2- T-тест аміно-2-гідроксиметил-пропан-1,3-діолу t-тест Стьюдента s-тест США ультразвук VAV прото-онкоген vav VCAM-1 молекула адгезії судинних клітин-1, CD 106 мас./Об. 1 розчинний у воді тетразолій-1 xg n-кратне прискорення за рахунок сили тяжіння, напр. наприклад C градусів Цельсія
Резюме 2 і клітинні лінії меланоми людини відбувались за допомогою кількісної ланцюгової реакції полімерази в реальному часі (qrt-pcr). Аналіз передбачуваних мішеней, що регулюються дієтичним куркуміном, показав, що вони були надмірно представлені в клітинних сигнальних шляхах біосинтезу О-глікану, обробці білка в ендоплазматичній сітці та різних сигнальних шляхах, пов'язаних з раком. Вестерн-блот-аналізи показали, що антиапоптотична В-клітинна ХЛЛ/лімфома 2 (Bcl-2) та проліферуючий клітинний ядерний антиген (PCNA) суттєво знижуються в лікуваних куркуміном пухлинах. Підводячи підсумок, результати цієї роботи продемонстрували, що децетен-куркумін, який є більш токсичним для ракових клітин, ніж куркумін, утворюється в результаті піролітичної деградації під час звичайної побутової кулінарії. Крім того, було виявлено фундаментальну зміну сигнатури mirna у трансплантованих меланомах через дієтичний куркумін. Тут mmu-mir-205-5p найбільше регулювався. Вплив перорально введеного куркуміну на важливу регуляторну мережу пухлин було доведено та підкреслює потенційну користь куркуміну в лікуванні злоякісної меланоми.
Резюме 4 збагатилося біосинтезом о-глікану, обробкою білка ендоплазматичної сітки та різними шляхами, пов'язаними з раком. Вестерн-блот-аналізи показали, що з цих мішеней антиапоптотичні В-клітинні ХЛЛ/лімфома 2 (Bcl-2) та проліферуючий клітинний ядерний антиген (PCNA) мають значне зниження при лікуванні куркуміном пухлин. На закінчення висновки цієї дисертації демонструють, що куртен декетену, який утворюється як наслідок піролітичної деградації під час звичайної побутової кулінарії, виявляє сильнішу токсичність на ракові клітини порівняно з куркуміном. Крім того, дієтичний куркумін спричинив глибоку зміну сигнатури mirna при прищепленій меланомі, причому mmu-mir-205-5p регулювався найбільш суттєво. Вплив перорально введеного куркуміну на важливу регуляторну мережу пухлин було задокументовано і підкреслює потенціал куркуміну в терапії злоякісної меланоми.
Вступ 7 Рис. 2: Curcuma longa. В: Креслення рослини куркуми (Келер, 1887). B: Фото кореневищ і порошку куркуми. Комерційно доступний куркумін зазвичай складається з приблизно 80% куркуміну, а також містить проміжні продукти біосинтезу рослин з подібним спектром активності, такі як деметоксикуркумін (
17%) та бідеметоксикуркумін (
3%) (рис. 3). Хоча в Європі та США куркумін в основному використовується як фарбувальна харчова добавка (E100, Natural Yellow 3), його споживання та використання в традиційній медицині широко поширені в Південно-Східній Азії. Понад 2000 років куркумін використовується в традиційній азіатській кухні як основний компонент каррі та для фарбування солодощів і застосовується в лікуванні інфекцій та внутрішніх захворювань (Ammon, 1991; Eigner and Scholz, 1999). З часткою 80% (близько 800 000 т у 2010 р.) Індія є головним світовим виробником куркуми, 90% якої переробляється на внутрішньому ринку (Universal Commodity Exchange, 2012). Середнє споживання становить 2,0-2,5 г куркуми на день на людину і відповідає споживанню куркуміну до 100 мг (Chainani-Wu, 2003). Для порівняння, Європейський орган з безпеки харчових продуктів у Великобританії підраховує, що 0,8-3,3 мг/кг маси тіла на день споживають дорослі (European Food Safety Authority, 2010).
Вступ 10 різних пропорцій транс-6- (4-гідрокси-3-метоксифеніл) -2,4-діоксо-5-гексаналу, ферулової кислоти, ферулоїлметану та ваніліну (Wang et al., 1997). Куркумін добре розчиняється в органічних розчинниках, таких як спирти або деметилсульфоксид (ДМСО), але лише з труднощами у воді. Це призводить до зменшення клітинного всмоктування в кишечнику і, як наслідок, до зниження біодоступності. 2.2.2. Фармакокінетика куркуміну Доклінічні та клінічні дослідження фармакокінетики куркуміну показали низьку системну біодоступність та швидкий метаболізм першого проходження та виведення первинної речовини. Одне з перших досліджень Wahlström і Blennow (1978) показало, що куркумін, що вводиться перорально у щурів Спраг-Доулі, активно транспортується з печінки в жовч і 75% виводиться з калом. У плазмі та сечі було виявлено лише незначну частку. 6: Метаболізм куркуміну (модифіковано з Sharma, 2005) Біліарна екскреція куркуміну, в свою чергу, опосередковується білком 2, пов’язаним із стійкістю до різних лікарських засобів (MRP2) (Lee et al., 2012). В експериментах in vitro також були
Матеріал і методи 21 промивали холодним PBS, а клітини потім підраховували вручну в лічильній камері Нойбауера (гемоцитометр). Буфер лізису еритроцитів: 788 мг (10 мм) трис-HCl 4,41 г (165 мм) NH 4 Cl хімічних речовин у 500 мл водного бідеста. розчинити і зберігати при 4 С. 3.2.4. Підрахунок клітин Для підрахунку клітин 10 мкл суспензії клітин змішували з 10 мкл трипанового синього (коефіцієнт розведення: 2), а життєво важливі (незабарвлені) клітини підраховували в лічильній камері Нойбауера (рис. 10). Трипан-синій барвник проникає через пошкоджені клітинні мембрани і тим самим позначає нежиттєві клітини. Другу аликвоту 10 мкл суспензії клітин змішували з розчином Турка і додавали до лічильної камери Нойбауера для визначення кількості білих кров'яних клітин. Оцтова кислота, що міститься в розчині Тюркса, лізує еритроцити так, що вони забарвлюються в синій колір. 10: Лічильна камера Нойбауера. В: Схематичне зображення гемоцитометра в поперечному перерізі. Б: Схематичне зображення області підрахунку. Квадранти, що підраховуються, позначені червоним кольором (Woermann, 2000). Для розрахунку життєво важливих РВМС необхідно враховувати об’єм рідини в лічильній камері та розведення клітин у фарбувальних розчинах. Площа
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ 29 Щоб знайти рівень експресії мірнасів між контрольною та лікувальною групами, використовували незалежний двосторонній s-тест Стьюдента. Розраховані значення P були скориговані з коефіцієнтом помилкового виявлення (FDR) для повторного тестування (Benjamini and Hochberg, 1995). Дерегульована мирна з виправленим значенням Р 20%, діаметром пухлини> 15 мм та розвитком некрозу тканин. Якщо не описано інше, втручання проводилися під внутрішньочеревною анестезією кетамін-ксилазін (кетамін: 75 мг/кг, Ketanest, Pharmacia GmbH, Ерланген, Німеччина; ксилазин: 15 мг/кг, Rompun, Bayer, Leverkusen, Німеччина). Після закінчення експериментів тваринам давали передозування пентобарбіталом (200
Матеріали та методи 46 Рис. 18: Інтравітальна флуоресцентна мікроскопія. Налаштування флуоресцентного мікроскопа (FM) з лампою з ртутними парами (HBO), лінзами великої відстані (LDO) та системою відеодокументації з відеокамерою (VK) та DVD-рекордером (DVD). Дані оцінювали в автономному режимі за допомогою програмного забезпечення CapImage (Zeintl, Гейдельберг, Німеччина). Аналізи включали вимірювання розміру пухлини [мм 2] та функціональної щільності капілярів [см/см 2]. Це визначається як загальна довжина перфузійних судин на поле зору. У цій роботі аналізували функціональну щільність капілярів повного сфероїда пухлини. 3.10. Модель пухлини флангу Генерацію пухлин флангу та ультразвукові вимірювання проводили за люб'язної підтримки Жанетт Рудзітіс-Аут, Інститут клініко-експериментальної хірургії, Університет Саар. 3.10.1. Вироблення пухлин флангу Для того, щоб генерувати пухлини флангу, самців мишей C57BL/6 короткочасно знеболювали сумішшю 4% ізофлурану та кисню. Кожній миші вводили підшкірно 1 × 10 5 клітин меланоми B78H1 на фланг в обсязі 50 мкл PBS.
Застосовуються матеріали та методи 50. В аналізі post hoc альфа-похибка згідно Бонферроні була скоригована з метою виправлення для повторних вимірювань. Значення P