Апоптоз кератиноцитів відбувається з інфільтрацією лімфоцитів cd8 та накопиченням

предметів

реферат

Імунопатоморфологічне фарбування зразків тканин дає можливість мікроскопічно оцінити морфологічні деталі, фенотипи та наявність маркерів активації в інфільтруючих клітинах. Наявність лімфоцитів, головним чином CD8 +, поблизу епітеліальних клітин шкіри1 та наявність одноклітинного апоптозу свідчать про гострий GVHD. .4-NORs характеризує клітини в клітинному циклі.5 Це тлумачилось як ознака підвищеної швидкості проліферації шкірних кератиноцитів при гострих ураженнях РТПХ. Накопичення NOR показує, що клітини перебувають у клітинному циклі, але це може не завершитися успішним мітозом. Якщо ділення клітин неможливо завершити, процес закінчується апоптозом.6

У цій роботі ми досліджували взаємозв'язок між ступенем інфільтрації лімфоцитів та наявністю Ki67 + та апоптотичних клітин у біоптатах шкіри, отриманих у пацієнтів із гострими РТПХ. Крім того, оцінювали позитивність кератиноцитів до PCNA, цикліну А та циклу поділу клітин 2 (cdc2). Цей комплексний аналіз показав порушення циклу росту кератиноцитів у пацієнтів після ІМТ, що, ймовірно, сприятиме апоптотичним процесам, пов'язаним із ступенем локальної інфільтрації клітин CD8 +.

Пацієнти та методи

Пацієнт

Вісімнадцять випадків (10 дорослих та 8 дітей) із хронічним мієлоїдним лейкозом (n = 6), гострим лейкозом та мієлодиспластичним синдромом (n = 7), апластичною анемією та анемією Фанконі (n = 5) були виявлені або з ІМ (12 пацієнтів), або з PBPC (5 пацієнтів). Один пацієнт (ХМЛ) отримував PBPC від матері (альтернативна трансплантація донора) (Таблиця 1).

Режим кондиціонування складався з бусульфану (BU) 4 мг/кг маси тіла та циклофосфаміду (CY) 50 мг/кг маси тіла, що вводився протягом 4 днів (загальна доза 16 мг/кг маси тіла та 200 мг/кг маси тіла BU або CY) для восьми хворих на лейкемію зі стандартним ризиком або BU 4 мг/кг маси тіла протягом 4 днів (загальна доза 16 мг/кг маси тіла) та CY 60 мг/кг протягом 2 днів (загальна доза 120 мг/кг маси тіла), доповнений 5–15 мг/кг т. Днів (загальна доза 10–30 мг/кг т. Д.) Або 250 мг/м 2 тіотепи за 3 дні (загальна доза 750 мг/м 2) у трьох або двох пацієнтів із низьким ризиком. Випадки ФА отримували 5–15 мг/кг маси тіла антитимоцитарного глобуліну (ATG, Fresenius, Бад-Хомбург, Німеччина) протягом 5 днів поспіль (загальна доза 25–75 мг/кг маси тіла) та CY 20 мг/кг маси тіла, вводили в 4 дні (загальна доза 80 мг/кг маси тіла). Пацієнти SAA отримували CY у дозі 50 мг/кг маси тіла через 4 дні (загальна доза 200 мг/кг маси тіла) та 5 мг/кг маси тіла ATG через 5 днів (загальна доза 25 мг/кг маси тіла) (Таблиця 1).

Гостра профілактика GVHD включала циклоспорин А (CsA) для зниження рівня сироватки між 100 і 200 нг/мл та метотрексату (МТХ) у дозі 10 мг/м 2 або 5 мг/м 2 (лише для пацієнтів із САА) на дні + Охопіть 1, +3, +6 та +11. MTX було припинено у двох випадках через токсичність слизової оболонки або печінки. Токсичність оцінювали за стандартними критеріями ВООЗ. Гострі симптоми РТПХ спонукали почати лікування преднізолоном із дози 2 мг/кг маси тіла, яку збільшували з інтервалом у 2 дні, якщо не було реакції.

Біопсії нормальної шкіри з чотирьох випадків (у віці від 15 до 49 років), які перенесли операцію на грудній клітці з приводу не злоякісних та незапальних захворювань, використовувались як контроль для дослідження маркерів циклу росту. Позначення лімфатичних вузлів метастатичними ураженнями задокументувало здатність антитіл до цикліну А, cdc2 та Ki67 виявляти клітини в клітинному циклі (не показано).

Методи

Біопсію шкіри брали при перших ознаках ураження шкіри до або на наступний день (за винятком одного випадку) після введення преднізолону (табл. 1).

Зрізи, пофарбовані H + E, оцінювали згідно з опублікованими критеріями гострих GVHD7 та апоптотичних уражень.8 Інфільтрація мононуклеарних клітин оцінювалася наступним чином: менше п'яти клітин у кластері, ступінь 0; 6–20 клітин у скупченні, ступінь 1; Від 21 до 50 клітин у скупченні, ступінь 2; Фокус містить більше 50 клітин у скупченні 3 ступеня та більше одного фокусу в тканині 4 ступеня.

Статистичний аналіз

Для статистичної оцінки результатів використовували U-тест Манна-Уїтні, точний тест Фішера та тест Стьюдента для парних зразків.

Результати

Послідовні біопсії шкіри (заморожені зрізи) пацієнта зі стероїдостійкою гострою РТПХ (UPN 88). Кількість епітеліальних клітин Ki67 + та апоптотичних клітин зростала, коли гостра РТПХ повністю виросла (+17 днів проти +31 дня після BMT) і знову зменшувалася на кінцевій стадії. Гостра РТПХ (+45 днів після BMT) (початкове збільшення × 400) .

Гострі парафінові зрізи блоку парафіну III ступеня GVHD, що фарбують білки, пов’язані з клітинним циклом, та апоптотичні клітини. Зверніть увагу на накопичення антигену Ki67, PCNA та цикліну А у збільшених ядрах клітин, відсутність Cdc2-позитивних клітин та певної кількості апоптотичних клітин у базальному шарі епітелію (початкове збільшення × 400).

Підраховували Ki67 позитивні клітини та оцінювали ступінь фарбування. Частка клітин Ki67 + у базальному шарі епідермісу була однаковою в обох зразках з апоптотичними клітинами та без них (медіана: 0,25 проти 0,2). Однак фарбування Ki67 + було набагато сильнішим у зрізах тканин із наявними апоптотичними клітинами. Клітинні ядра були більшими та сильніше помічені Ki67 MoAb, ніж біопсії без апоптозу (малюнки 1 та 2). Це зображення було видно в семи з дев'яти зразків з апоптотичними клітинами і лише кожному з дев'яти на зрізах тканин без апоптозу (Р = 0,008) (Таблиця 4).

Послідовні біопсії шкіри показали, що як кількість клітин Ki67 +, так і апоптотичні клітини зростали в міру прогресування гострої РТПХ. Клітини Ki67 + при запущеному гострому РТПХ групували по фокусах. У кінцевій стадії гострої РТПХ як Ki67 +, так і апоптотичні клітини зменшувались із зменшенням кількості епідермальних клітин (рис. 1). Фарбування PCNA слідувало за зразком Ki67, який був трохи меншим у біопсіях з токсичними ураженнями на відміну від гострої шкіри GVHD (не показано).

Пацієнти були згруповані за результатами фарбування TUNEL (табл. 1). Група 1 складалася з пацієнтів з апоптотичними клітинами, а група 2 - без апоптотичних клітин у біоптатах шкіри. Пацієнти з апоптотичними клітинами під час біоптатів шкіри були старшими, ніж пацієнти без апоптотичних клітин (середнє значення ± sem: 24, 8 ± 3, 7 проти 15, 2 ± 3, 4 роки; P = 0,042) і частіше отримували більш токсичне кондиціонування, до яких належав етопозид або тіотепа (4/9) проти 1/9, NS) (Таблиця 1). Обидва фактори могли сприяти виникненню серйозних токсичних ускладнень слизової оболонки, які частіше виникають у групі 1, ніж у групі 2 (Р = 0,013) (табл. 1). Усі пацієнти з позитивним фарбуванням шкіри на апоптотичні клітини (група 1) відповідали гістопатологічним та клінічним критеріям гострої РТПХ. Навіть на гострій стадії РТПХ вони були більш просунутими, ніж пацієнти групи 2 (Р = 0,015) (Таблиця 1).

Шість гострих РТПХ, дві біопсії шкіри з токсичними ураженнями та чотири контрольні зразки шкіри можуть бути досліджені на наявність забарвлення білка, пов’язаного із циклом росту, на ділянках парафінових блоків. У всіх восьми зразках (незалежно від того, чи мали вони гострі РТПХ або токсичні ураження), частота циклінових А-позитивних клітин була вищою, ніж у cdc2-позитивних клітин (32% проти 8%; Р = 0,072) (2 ) на відміну від нормальної шкіри, яка характеризувалася подібними частками циклінових А- та cdc2-позитивних клітин (3). Поширеність циклінових А-позитивних та cdc2-позитивних клітин спостерігали в біопсіях з гострим РТПХ незалежно від результатів фарбування TUNEL. Однак накопичення цикліну А спостерігалось у всіх чотирьох біопсіях з апоптотичними клітинами, але не в нормальній або хворій шкірі без апоптотичних клітин (вісім біопсій) (2 та 3). Структура фарбування цикліну А була подібною до карти Ki67. Те саме спостерігалося з цикліном А, коли накопичувався білок Ki67 (2).

Звичайні ділянки парафінових блоків шкіри забруднюють, як описано на малюнку 2. Слід зазначити, що поширеність PCNA порівняно з клітинами Ki67 + є позитивною, що циклінові А- та Cdc2-позитивні клітини присутні в рівних пропорціях і що верхній епітеліальний шар має коричневі (плями апоптотичних клітин) ядра апоптозу (оригінал Збільшення × 400).

обговорення

Кількість апоптотичних клітин була низькою, і вони спостерігались у пацієнтів з більш вираженою токсичністю для слизової та/або шкіри. Вони були пов’язані з тяжкістю гострої РТПХ та ступенем інфільтрації лімфоцитів у шкірі, але не з наявністю лімфоцитів в епідермісі. Тому апоптоз є частиною картини повномасштабної гострої РТПХ, яка включає пошкодження тканин та інфільтрацію лімфоцитів (табл. 2).

Здається, пошкодження шкіри у пацієнтів після ІМТ є двоступеневим процесом. Генотоксична образа спочатку впливає на клітинний цикл і призводить до дефекту на межі G 2/M. Незважаючи на відносно високу частку клітин, які є або Ki67- (рисунок 2), або AgNOR-позитивними, це призводить до низької мітотичної швидкості кератиноцитів.4 Ця ситуація робить клітини сприйнятливими до апоптотичної смерті. Механізм, за допомогою якого кінцевий апоптотичний удар потрапляє до кератиноцитів, не може бути виведений з цього дослідження, але, ймовірно, він пов'язаний з інфільтрацією лімфоцитів. Швидше, це може бути пов’язано з місцевим вивільненням запальних цитокінів, які можуть мати (наприклад, TNFα) потенціал зупинки росту22, але не безпосередньою ферментзалежною атакою лімфоцитів. Гранзим викликає апоптотичну смерть і вимагає активності cdc2-кінази 19, але, як видається, він відсутній в шкірі після ВМТ.