Aspergillus niger при отомікозі Хто такі чоловіки в чорному при отомікозі PDF Безкоштовно завантажити
Дисертація Aspergillus niger при отомікозі Хто такі чоловіки в чорному при отомікозі? подано Marcel Schöpfer Mat. No: 0412267 для здобуття вченого ступеня доктора медицини (Dr.med.univ.) в Медичному університеті Граца Експерт: доц. Прив.-доз. Інж. Маг. Д-р Вальтер Бузіна, Інститут гігієни, мікробіології та медицини довкілля. Професор доктор Доріс Ланг-Лойдолт, Університетська клініка ЛОР-центру Грац Грац, липень 2011 р
Декларація про честь Я заявляю про свою честь, що я сам підготував цю наукову роботу і здійснював діяльність, безпосередньо пов'язану з нею. Я також заявляю, що я не використовував жодних допоміжних засобів, крім зазначених. Я дотримався всіх авторських та договірних прав на використані джерела літератури, використовував лише зазначені джерела та позначив уривки, взяті дослівно, або стосовно змісту як такого із використаних джерел. Підтримка, яка надається під час робочого процесу, включаючи важливі інструкції щодо наставництва, зазначена повністю. Ця дисертація була подана в друкованому та електронному вигляді та ще не передана жодному іншому експертному органу. Грац, липень 2011 р. (Марсель Шепфер)
Подяки Я хотів би подякувати усім, хто допоміг мені виконати цю роботу: Інституту гігієни, мікробіології та екологічної медицини та Університетській клініці медицини вух, носа та горла в Граці та Інсбруку за надання необхідного обладнання та матеріалів. Доц. Прив.-доз. Інж. Маг. Д-р Вальтер Бузіна та університет-проф. Лікар. Доріс Ланг-Лойдолт за науковий нагляд. Всім колегам, особливо Беттіні Хайлінг, за практичну підтримку. Маг. Петру Чуфферу за виправлення цієї роботи. Моєму братові Патріку за графічну та технічну допомогу. Мої люблячі батьки, Вернер та Ельфріде, за супровід пацієнта та підтримку протягом усього вивчення людської медицини та сприяння важливому та незамінному етапу життя. Моєму кумові доктору Гельмут Шепфер, без якого я ніколи б не вивчав медицину.
Зміст 1. Вступ. 1 1.1 Історія. 1 1.2 Що таке отомікози. 4 1.3 Анатомія та гістологія зовнішнього слухового проходу. 6 1.4 Біологія грибів. 9 1.4.1 Класифікація та номенклатура. 9 1.4.2 Система D-H-S: класифікація медично важливих грибів. 11 1.4.3 Будова грибної клітини. 12 1.4.4 Фізіологія. 14 1.4.5 Умови життя та спосіб життя медично важливих грибів. 15 1.4.6 Мікопатії. 17 1.5 Мета роботи. 18 2. Матеріал і методи. 20 2.1 Робочі кроки. 20 2.2 Зразки матеріалів. 20 2.3 Культурні засоби. 21 2.4 Молекулярно-біологічна ідентифікація. 21 2.4.1 Виділення ДНК. 22 2.4.2 ПЛР. 22 2.4.3 Секвенування ДНК. 25 2.4.4 Аналіз послідовності та бази даних. 26 3. Результати. 27 3.1 Морфологія. 27 3.2 Молекулярно-біологічні результати. 31 3.2.1 Виділення ДНК та ПЛР. 32 3.2.2 Секвенування ДНК. 33 3.3 Медична документація. 57 3.4 Статистична оцінка демографічних даних усіх позитивних грибкових знахідок з вуха (2006-2010 рр.). 63 4. Обговорення. 67 4.1 Біологічна дискусія. 67 4.2 Клінічна дискусія. 69 5. Короткий зміст. 74 6. Анотація. 76 7. Література. 77 Додаток. 81
Скорочення А. д. Aqua distillata, дистильована вода bp пара основа ddntp дидеоксинуклеотид трифосфат dntp дезоксинуклеотид трифосфат ДНК Дезоксирибонуклеїнова кислота, дезоксирибонуклеїнова кислота EDTA етилендіамінтетрауксусна кислота Eppi 1,5 мл реакційний посудину EtBr етидіум бромід хв відцентрова сила RT кімнатна температура від A. Aspergillus Taq Thermus aquaticus GG правий слуховий прохід. праворуч ліворуч ліва РНК рибонуклеїнова кислота bt2a/b тубуліновий праймер o. B. без знахідок sp./spp. Види/Кілька видів
Барабанна перетинка (Membrana tympanica) Барабанна перетинка - це жилава шкіра між зовнішнім слуховим проходом і барабанною порожниною з тришаровою структурою, це межа між зовнішнім і середнім вухом. Aspergillus niger при отомікозах 8
2. Матеріал та методи 2.1 Робочі етапи Організація робочих етапів, які будуть детально розглянуті нижче: Заява до етичного комітету з голосуванням у додатку ЛОР-швидкої допомоги + мазки із зовнішнього слухового проходу за допомогою мазків Вирощування мазків на бактеріологічних та мікологічних середовищах ДНК після 24 годин ITS-PCR TS-секвенування тубуліну для точнішої диференціації між двома типами. 2.2 Зразки матеріалів Особи, яким діагностовано вушну інфекцію в амбулаторних відділеннях УНГ-клініки Університету Грац та Інсбрук, мали право на дослідження. Після того, як учасники дослідження були проінформовані та дали свою згоду, мазки взяли із зовнішнього слухового проходу за допомогою мазків (стерильних транспортних тампонів Copan). Aspergillus niger при отомікозах 20
сочевичні гриби. Варіація некодуючої області ІТС використовується для розмежування між родами та популяціями. Спочатку готують основну суміш для реакції ПЛР, в якій містяться всі компоненти (пара праймерів, чотири нуклеотиди, буфер та ДНК-полімераза), крім ДНК. 18,8 мкл цього розпилюють у ланцюги реакційних посудин по 0,2 мл і до кожного додають 1,2 мкл ДНК. Позитивний і негативний контроль включаються в кожну партію. Для точного розмежування Aspergillus tubingenisis та Aspergillus foetidus ген тубуліну ампліфікували та секвенували з праймерами bt2a та bt2b. Aspergillus niger при отомікозах 23
3. Результати 3.1 Морфологія Культури спочатку піддавали макроскопічному та мікроскопічному контролю (рис. 2-7). З нашого боку неможливо провести диференціацію. Aspergillus niger при отомікозах 27
Рисунок 2: Культура Aspergillus foetidus на Сабуро Рисунок 3: Aspergillus foetidus мікроскопічно Aspergillus niger у отомікозах 28
Малюнок 4: Культура Aspergillus niger на Сабуро Рисунок 5: Aspergillus niger мікроскопічно Aspergillus niger у отомікозах 29
Малюнок 6: Культура Aspergillus tubingensis на Сабуро Рисунок 7: Aspergillus tubingensis мікроскопічно Aspergillus niger при отомікозах 30
Істотних відмінностей між окремими видами Aspergillus не виявлено. 3.2 Молекулярно-біологічні результати Оскільки між чорною аспергілою не було ніяких макроскопічних та мікроскопічних відмінностей, ми націлилися на молекулярно-біологічну ідентифікацію за допомогою змінної та некодуючої ІТС області рибосомної ДНК та гена тубуліну для багатьох грибів. ДНК виділили з наших грибів, а аналіз послідовності розпочали після ПЛР. Aspergillus niger при отомікозах 31
3.2.1 Виділення ДНК та ПЛР Першим етапом контролю для успішного проведення ПЛР був агарозний гель з нашими продуктами ПЛР. Очищення та секвенування можна було розпочати з тих зразків, смуги яких були добре помітні. Рисунок 8: Агарозний гель продуктів ПЛР (ITS), забарвлений EtBr Рисунок 9: Агарозний гель продуктів ПЛР (-Тубулін), забарвлений EtBr Aspergillus niger при отомікозах 32
3.2.2 ДНК-секвенування області ITS В якості еталону використовували штами CBS Aspergillus niger (CBS 554.65), Aspergillus foetidus (CBS 56465) та Aspergillus tubingensis (CBS 134.48). Aspergillus niger відрізняли від Aspergillus foetidus та Aspergillus tubingensis на основі відмінностей основ G 56 A, C 109 T, C 514 T (вирівнювання див. Нижче). Шукали диференціацію між двома останніми на основі гена, що кодує тубулін. Aspergillus niger при отомікозах 33
3.3 Медичні записи У 15 пацієнтів, крім точної молекулярно-біологічної ідентифікації, дані грибів ретроспективно порівнювали з клінічними даними. Дані надходять із клінічної комунікаційної та інформаційної мережі MEDOCS. Aspergillus niger при отомікозах 57
3.4 Статистична оцінка демографічних даних усіх позитивних грибкових знахідок з вуха (2006-2010) Статистична оцінка всіх позитивних грибкових знахідок з вуха в період з 2006 по 2010 рік з мікологічної лабораторії Інституту гігієни, мікробіології та екологічної медицини показала 425 позитивних грибкових знахідок із 360 Пацієнт. Всього було виявлено 478 грибків, що можна пояснити повторними появами окремих пацієнтів та наявністю змішаних чи множинних знахідок. Виявлені гриби включали 28 різних видів. У нашому аналізі Candida parapsilosis найчастіше виявляли в слуховій трубі, а потім A. niger sensu lato. (Таблиця 6, малюнки 10 та 11) Aspergillus niger при отомікозах 63
Таблиця 6: Спектр грибів (2006-2010) Кількість назв зародків/назва зародків% на основі кількості/назви зародків Candida parapsilosis 139 29,08% Aspergillus niger 97 20,29% Aspergillus fumigatus 85 17,78% Candida albicans 83 17,36% Aspergillus flavus 23 4,81% Pseudallescheria boydii 7 1,46% Candida glabrata 6 1,26% Candida lusitaniae (Clavispora lusitaniae) 4 0,84% Гриби 3 0,63% Scopulariopsis brevicaulis 3 0,63% Aspergillus candidus 3 0,63% Trichophyton mentagrophytes 2 0,42% Candida non-albicans 2 0,42% Candida Gilliermondii (Pichia Gilliermondii) 2 0,42% Aspergillus sclerotiorum 2 0,42% Стерильний міцелій 1 0,21% Scopulariopsis sp. 1 0,21% Scedosporium apiospermum 1 0,21% Paecilomyces sp. 1 0,21% Microsporum canis 1 0,21% Exophiala dermatitidis 1 0,21% Chrysosporium queenslandicum 1 0,21% Candida utilis 1 0,21% Candida tropicalis 1 0,21% Candida magnoliae 0,21% Candida famata 1 0,21% Candida ciferrii (Stephanoascus ciferrii) 1 0,21% Aspergillus terreus 1 0,21% Aspergillus sydowii 1 0,21% Aspergillus sp. 1 0,21% Aspergillus oryzae 1 0,21% Aspergillus glaucus 1 0,21% Всього 478 100% Aspergillus niger при отомікозах 64
Ниткоподібні гриби (n = 233) проти паростків (n = 245) (n = 478) Ниткоподібні гриби 49% Паростки гриби 51% Рисунок 10: Діаграма ниткоподібних грибів проти пагонів усіх позитивних знахідок % 36% 12% 42% Aspergillus niger Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Інше Рисунок 11: Діаграма ниткоподібних грибів усіх позитивних грибкових знахідок (2006-2010) Aspergillus niger при отомікозах 65
Розподіл за статтю (n = 360) жінки 43% чоловіки 57% Рисунок 12: Розподіл статі пацієнтів з усіма позитивними виявленнями грибків (2006-2010 рр.) Пацієнти чоловічої статі частіше стикалися з виявленням грибків у вусі. Однак результати неможливо простежити за діагностованими отомікозами, а лише дають огляд грибків, виявлених у вусі за останні п’ять років. Віковий розподіл позитивних результатів грибів у% (n = 360) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 18 18 16 13 13 8 8 3 4 0-10 11-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61 -70 71-80> 80 Рисунок 13: Розподіл за віком пацієнтів з усіма позитивними виявленнями грибків (2006-2010 рр.) Середній вік становив 52,3 року із середнім значенням 52 та стандартним відхиленням 19,88 року. Вікові групи від 41 до 50 років та від 51 до 60 років (по 18% кожна) найчастіше стикалися з позитивними виявленнями грибків. Aspergillus niger при отомікозах 66
як і дріжджі, були настільки ж присутні, як і поодинока присутність Aspergillus niger.Нарешті, були перевірені знахідки грибів (з вуха) за останні п'ять років у більшій частині Грацу. З 425 позитивних результатів грибків та 360 пацієнтів ми виявили вузьку більшість на користь дріжджів (51%) порівняно з ниткоподібними грибами (49%). Переважним ізолятом серед 28 різних видів був Candida parapsilosis (29%), другою за поширеністю і, отже, найпоширенішою цвіллю була Aspergillus niger sensu lato (20%). Середній вік становив 52,3 року (медіана: 52) при стандартному відхиленні 19,88 року. Вікові групи від 41 до 50 років та від 51 до 60 років (кожна 18%) найчастіше стикалися з позитивними виявленнями грибків. Чоловіки (57%) частіше стикалися з позитивним грибковим результатом, ніж жінки (43%). Aspergillus niger при отомікозах 75