Бактерицидна дія вторинної рослинної речовини ізотіоціанату - ГРІН

Технічна робота (школа), 2012

36 сторінок, оцінка: 1,0

Йоганнес Ресслер (Автор)

Зміст

2. Теоретичні основи
2.1 Природне виникнення глюкозидів
2.2 Значення ізотіоціанату для рослини
2.3 Хімічні принципи
2.3.1 Глюкозиди
2.3.2 Синігрін
2.3.3 Ізотіоціанат
2.4 Ферментативне перетворення
2.5 Мета семінарської роботи

грін

3. Експериментальне впровадження та пояснення
3.1 Використані інструкції до тестування
3.2 Екстракції
3.2.1 Екстракція синігріну
3.2.2 Екстракція мірозинази
3.3 Ферментативний гідроліз глюкозидного екстракту до ізотіоціанату
3.4 тонкошарові хроматографії
3.4.1 Пояснення методу тонкошарової хроматографії
3.4.2 Виконання тонкошарової хроматографії на синігріні
3.4.3 Проведення тонкошарової хроматографії на ізотіоціанаті
3.4.4 Проведення тонкошарової хроматографії на ізотіоціанаті та синігріні
3,5 ферментний тест
3.5.1 Виконання ферментного тесту
3.5.2 Виконання тонкошарової хроматографії ферментного тесту
3.5.3 Пояснення ферментного тесту
3.6 Антибактеріальні методи виявлення
3.6.1 Інгібіційний тест для демонстрації антибактеріального ефекту ізотіоціанату
3.6.2 Біоавтографія

4. Результати
4.1 Результати тонкошарової хроматографії
4.1.1 Результати тонкошарової хроматографії Синігріну
4.1.2 Результати тонкошарової хроматографії ізотіоціанату
4.1.3 Результати тонкошарової хроматографії ізотіоціанату та синігріну
4.1.4 Результати тонкошарової хроматографії тесту на ферменти
4.1.5 Значення Rf для представлення відносної відстані пробігу в постійному струмі
4.2 Результати методів антибактеріального виявлення
4.2.1 Результат тесту на гальмування
4.2.2 Результат біоавтографії

7. Додаток
7.1 Список скорочень
7.2 Таблиці

1. Вступ

2. Теоретичні основи

2.1 Природне виникнення глюкозидів

Глюкозиди утворюються з амінокислот при вторинному метаболізмі рослин (Watzl, 2001). Амінокислоти розщеплюються до альдоксиму, який декарбоксилюється до фенілоцтової кислоти, а потім до глюкозиду (Kindl, 1975). Глюкозиди зустрічаються в природі лише в рослинах вищого роду (Dörnemann, 2008), наприклад, у сімействі хрестоцвітних (Brassicaceae, синонім. Cruciferae; Ahlheim, 1983) як найважливіший представник роду (Luciano, 2009). Однак глюкозиди також можна знайти в каперсах (Capparidaceae), настурціях (Tropaeolaceae) та рослинах Reseda (Rescedaceae) (Dörnemann, 2008). В даний час відомо близько 130 різних глюкозидів (Wittstock, 2004). Вміст сухої речовини в глюкозидах може становити до 1% у деяких видів Brassica (Watzl, 2001), але кількість глюкозидів у дикій формі може перевищувати кількість, що міститься в культивованій рослині, в 1000 разів (Watzl, 2001).

Глюкозиди гірчичного масла містяться в рослинах гірчиці (Sinapis), які також належать до сімейства хрестоцвітних (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Однак різні типи гірчиці утворюють суміш різних глюкозидів гірчичного масла (Lara-Lledó, 2012). Біла гірчиця (Sinapis alba) в основному виробляє синапін, тоді як чорна гірчиця (Brassica nigra) та східна гірчиця (Brassica juncea) виробляють переважно синігрін (Lara-Lledó, 2012). Загалом, поява різкого запаху після знищення клітинної тканини рослини може свідчити про наявність глюкозидів гірчичного масла (Dörnemann, 2008). Цей різкий запах викликають гірчичні олії (ізотіоціанати), вони виникають внаслідок ферментативного розпаду глюкозиду гірчичного масла.

Фермент, який гідролізує глюкозид гірчичного масла, називається мірозиназою або β-тіоглюкозидазою (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Він зустрічається у всіх рослин, що виробляють гірчичні олії.

2.2 Значення ізотіоціанату для рослини

Продукти ферментативної деградації глюкозидів гірчичного масла забезпечують рослину високоефективними захисними речовинами проти хижаків (рослиноїдні тварини) та рослинних патогенних мікроорганізмів (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Ці продукти являють собою різні ізотіоціанати (ITC), тіоціанати та нітрили, надзвичайно токсичні для мікробіологічних організмів (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). Ізотіоціанат лише має бактерицидну, фунгіцидну, гербіцидну та токсичну дію на тканини тварин (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).

Ця форма самозахисту рослин відома як конститутивна оборона, оскільки попередня стадія захисного агента формувалася в клітині до контакту з рослиноїдними або збудником. Однак рослинний токсин виробляється лише тоді, коли клітинна структура безпосередньо поранена. Цей процес часто називають "бомбою" рослинного гірчичного масла, оскільки він "спрацьовує" лише тоді, коли два компоненти вступають у прямий контакт (Wittstock, 2004).

У рослині гірчиці або насінині гірчиці глюкозид гірчичної олії та мірозиназа просторово відокремлені один від одного. Ферментний субстрат (глюкозид гірчичного масла) розташований у відділеннях (вакуолях) поблизу клітинної стінки (Rausch, 1999), тоді як фермент (мірозиназа) розподіляється у так званих індобластах (спеціалізовані клітини/«диваки» клітинної структури) (Sitte, 1998) . Фермент та його субстрат контактують через механічну дію, після чого починається реакція, і захисний токсин розгортає свою дію (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Однак інші рослини, що містять глюкозиди, по-різному зберігають субстрат та фермент. Крес, таловий (Arabidopsis thaliana), наприклад, утворює поблизу сита так звані глюкозид-містять S-клітини, а також власні клітини мірозинази на корі (Wittstock, 2004).

2.3 Хімічні основи

2.3.1 Глюкозиди

Глюкозиди (глюкозинолати) (рис. 1) - це хімічно стабільні, нелеткі, іонні біомолекули, які належать до групи сірковмісних метаболітів. Вони складаються з одиниці глюкози на сірково-азотовмісній групі, сульфатній групі та змінному залишку.Таким чином, структура є комбінацією залишку тіоглюкози на ефірі N-гідроксиіміносульфату та залишку аглюкону (R, див. Нижче). Цей радикал може складатися з алкільної, алкенільної, арильної або індолільної групи. Він визначає фізіологічний ефект (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). Існує катіон на сульфатній групі, як правило, K + (Dörnemann, 2008).

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 1: Загальна структура глюкозиду гірчичного масла

Номенклатура глюкозидів різна, тому, коли утворюється загальна назва, перед назвою рослини стоїть “Глюкоза” і додається закінчення “в”. Наприклад, глюкозид крес-салату (Nasturtium officinale) позначається як "глюко-настурція" (Dörnemann, 2008). Однак систематична назва є більш точною, як показано на малюнку 2.

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 2: Приклад номенклатури крес-салату

2.3.2 Синігрін

Систематична назва синігріну - алілглюкозинолат, хімічна речовина - 1- (N- (сульфокси)-

3-бутенимідат-1-тіо-β-D-глюкопіраноза. Емпірична формула:

[C10H16NO9S2] −K +. Молекулярна маса становить 397,46 г/моль (Sigma-Aldrich). На малюнку 3 показано структуру синігріну.

Рисунок 3: Молекулярна структура синігріну

Рисунок не включений до цього витягу

2.3.3 Ізотіоціанат

Ізотіоціанати узагальнено під терміном «гірчичні олії». Ізотіоціанати - це леткі і хімічно нестійкі молекули, якщо вони утворені з індоїлглюкозинолатів. Вони спонтанно розпадаються до індол-3-карбінолу та інших сполук індолу (Watzl, 2001). Вони виникають внаслідок ферментативного розщеплення глюкозиду гірчичного масла і мають токсичну дію. Основна структура така (рис. 4):

Рисунок не включений до цього витягу

Малюнок 4: Загальна молекулярна структура ITC

Коли конвертується алілглюкозинолат, утворюється аллілізотіоціанат (AITC) (Aires, 2009). Емпіричною формулою для цього є C4H5NS (структурна формула див. Рисунок 5). Молекулярна маса становить 99,15 г/моль (Sigma-Aldrich).

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 5: Молекулярна структура AITC

2.4 Ферментативне перетворення

Гідроліз глюкозиду гірчичного масла до гірчичного каталізується мірозиназою, завдяки чому сірково-глюкозний зв’язок субстрату (глюкозид гірчичного масла) гідролізується (Wittstock, 2004). Утворюються еквімолярні кількості β-D-глюкози, сульфату та глюкозид-специфічного аглюкону. Аскорбінова кислота діє тут як кофермент, оскільки вона може забезпечити нуклеофільну каталітичну групу. Нестабільний аглюкон реагує далі на первинний продукт, ізотіоціанат, залежно від значення рН та температури (Wittstock, 2004). Також утворюються вторинні продукти, такі як тіоціанати, нітрили та епітіонітрили (Lara-Lledó, 2012). Ізотіоціанати переважно утворюються при нейтральному значенні рН, тоді як нітрили утворюються при кислому значенні рН (Wittstock, 2004). На рисунку 6 наведено огляд процесу ферментативного перетворення.

Рисунок не включений до цього витягу

Малюнок 6: Механізм та продукти ферментативного перетворення глюкозидів

2.5 Мета семінарської роботи

Метою даної роботи є вилучення гірчичного масла глюкозид синігрін та ферменту мірозинази з насіння гірчиці. Фермент повинен гідролізувати глюкозид до ізотіоціанату (ІТК). Крім того, слід підтвердити антибактеріальну дію продукту ферментативної реакції та визначити ІТЦ у суміші речовин реакції.

Метою цієї роботи було вперше визначити, чи спрощений варіант методу біоавтографії (Reusser, 1967) придатний для відділення ізотіоціанату від реакційної суміші процесу екстракції (тонкошарова хроматографія) та ідентифікації його через токсичну дію на бактерії.

Експерименти проводились із насінням Brassica juncea, оскільки, згідно з інформацією Develey GmbH, вони містять більше глюкозиду гірчичного масла, ніж насіння Sinapis alba, описані в інструкції до експерименту (Dörnemann, 2008).

3. Експериментальне впровадження та пояснення

3.1 Використані інструкції до тестування

Інструкції з випробування для екстракції мірозинази та синігріну, протокол ферментативного перетворення та впровадження тонкошарової хроматографії (ТШХ), є здебільшого інструкціями для курсу: "Вторинні рослинні інгредієнти" від PD Dr. Дітер Дорнманн, Філіппський університет Марбурга, на кафедрі біології (фізіологія рослин/фотобіологія) взято (Dörnemann, 2008).

Однак окремі підпроцедури були змінені незалежно. Гірчиця сорту Brassica juncea використовувалась для вилучення синігріну та мірозинази, оскільки цей сорт має найвищий вміст синігріну і, відповідно, згідно з літературою, виявляє найсильніший антибактеріальний ефект (Lara-Lledó, 2012).

Інструкції для тесту на пригнічення бактерій взяті з книги “Mikrobiologisches Praktikum” (Drews, 1983). Метод біоавтографії був модифікований з: "Метод біоавтографії тонкошарових хроматограм" (Reusser, 1967).

3.2 Екстракції

3.2.1 Екстракція синігріну

Процес очищення синігріну розпочався з подрібнення 10 г насіння гірчиці в ступці з додаванням 30 мл 80% етанолу (вод.). Це руйнувало структуру клітин і вивільняло глюкозид. Спирт запобігав ферментативному перетворенню синігріну мірозиназою. Потім однорідну масу переносили в одногорлу колбу і доводили до 100 мл 80% -ного етанолу (вод.). Потім продукт кип'ятили протягом 60 хвилин із зворотним холодильником (Малюнок 7), нагріваючи на водяній бані, і температура кипіння становила приблизно.

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 7: Екстракція синігріну на малюнку 8: Колба з

Водяна баня з дефлегматором 1. Екстракція синігріну

В результаті синігрін зв’язувався у етанолово-водній фазі суміші. Потім водний супернатант етанолу видаляли (1-а екстракція, малюнок 8). За допомогою цього методу залишок знову змішували з 50 мл 80% -ного етанолу (водн.) І цього разу його кип’ятяли лише протягом 30 хвилин із зворотним холодильником. Ця друга екстракція повинна збільшити вихід синігріну. Супернатанти двох екстракцій об'єднували і центрифугували для повного відділення твердих речовин, і супернатант знову відбирали для подальшої обробки. У роторному випарнику (малюнки 9 і 10) весь етанол витягували під вакуумом, а синігрін концентрували у водній фазі (малюнок 11).

Рисунок не включений до цього витягу

Малюнок 10: Перед концентрацією

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 9: Ротаційний випарник Рисунок 11: Після концентрування

Згодом суміш спочатку доводили до 10 мл H2O (dd) із сильним біло-жовтуватим осадом. Потім його доливали до 30 мл H2O (dd). Потім його кілька разів екстрагували діетиловим ефіром, в результаті чого гідрофобні компоненти (наприклад, клітинні ліпіди) переходили в ефірну фазу і видалялися з екстракту, піднімаючи і повторно використовуючи нижню фазу. Згаданий білий осад можна видалити ефірною екстракцією. Потім водну фазу, що містить синігрін, концентрували до 5 мл у роторному випарнику для концентрування синігріну. Побічним ефектом випаровування є повне видалення решти діетилового ефіру. Отриманий препарат розділили на аликвоти 4 × 200 мкл і заморозили при -20 ° C або піддали тонкошаровій хроматографії та ферментативному перетворенню.

3.2.2 Екстракція мірозинази

Для того, щоб інгібувати клітинні протеази, які можуть розщеплювати фермент, що підлягає екстрагуванню мірозиназою, всі стадії очищення проводили охолодженим способом, тому розчин, маточку та столові прилади охолоджували N2 (рідина) перед експериментом. Тепер 20 г насіння гірчиці (рис. 12) подрібнювали, вивільняючи фермент з клітин.

Рисунок не включений до цього витягу

Рисунок 12: Зенкер Рисунок 13: Декантування Рисунок 14: Діалізна трубка

3.3 Ферментативний гідроліз глюкозидного екстракту до ізотіоціанату

Заголовок Бактерицидна дія вторинної рослинної речовини ізотіоціанату (гірчичне масло) Клас 1.0 Автор Йоханнес Ресслер (Автор) Рік 2012 Сторінки 36 Номер каталогу V300661 ISBN (електронна книга) 9783656966845 ISBN (книга) 9783656966852 Розмір файлу 1824 KB Мова Німецька Примітки 1-й приз 10-ї студентської конференції Технічного Мюнхенський університет, співпраця з Helmholtz Zentrum München, підтримується Develey GmbH. Ключові слова Графінг гімназії, Технічний університет Мюнхена, Центр Гельмгольца, Мюнхен, студентська конференція ТУМ, гірчиця, гірчичне масло, глюкозид, ізотіоціанат, біоавтографія, мірозиназа, бактерицидний ефект, синапис юнченя, тонкошарова хроматографія, тест на інгібування бактерій, хімія, біохімія, семінарська робота Ціна (книга) 14,99 € Ціна (книга) € 14,99 (електронна книга) 12,99 € роботи з посиланням на Йоганнеса Ресслера (автор), 2012 р., бактерицидна дія вторинної рослинної речовини ізотіоціанат (гірчичне масло), Мюнхен, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/300661

  • Поки коментарів немає.