Блокування активності tlr2 зменшується і стабілізує розвинені атеросклеротичні ураження в

tlr2

  • Анотація
  • Мета:
  • Методи:
  • Результати:
  • Висновок:
  • вступ
  • Матеріали і методи
  • Тварини та експериментальний дизайн
  • Збір і обробка тканин
  • Біохімічний аналіз
  • Гістологічне та імуногістохімічне фарбування
  • Тестування in situ від dTC-опосередковане тегування нікендів від ToT
  • Вестерн-ляпси
  • статистичний аналіз
  • Результати
  • Блокування активності TLR2 зменшує і стабілізує атеросклеротичні ураження брахіоцефальної артерії
  • Блокада TLR2 полегшує запалення атеросклеротичних артерій
  • Блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів та експресію CHOP при атеросклеротичних стадіях, що розвиваються
  • TLR2 бере участь у прискореному формуванні атеросклерозу та регулює експресію CHOP та апоптоз у мишей з дефіцитом ApoE, які отримують дієти HC.
  • Обговорення
  • Внесок автора

Анотація

Мета:

Сигналізація про подібний до рецептора 2 (TLR2) відіграє важливу роль у ініціюванні атеросклерозу. Метою цього дослідження було дослідити, чи може блокування активності TLR2 мати терапевтичний вплив на розвинений атеросклероз.

Методи:

Сорокотижневим мишам з дефіцитом аполіпопротеїну Е (ApoE -/-), яким годували нормальну дієту, внутрішньовенно вводили нейтралізуюче антитіло TLR2 або відповідний ізотипу IgG протягом 18 тижнів. Подвійний нокаут мишей ApoE - Tlr2 -/- брали за позитивний контроль. В кінці процедур вимірювали рівень ліпідів у плазмі та аналізували морфологію нальоту, експресію прозапальних цитокінів та апоптоз в артеріях. У другій частині цього дослідження 6-тижневі миші ApoE -/- і ApoE -/- Tlr2 -/-, які годували дієту, що знижує рівень холестерину, протягом 12 - 24 тижнів, демонстрували рівні експресії TLR2 та маркери. артерій. обстежили.

Результати:

Блокада активності TLR2 нейтралізуючим антитілом TLR2 або інактивація гена Tlr2 не змінила рівні ліпідів у плазмі крові у мишей ApoE -/-. Однак генетичні та фармакологічні маніпуляції різко зменшили розмір нальоту та стеноз судин, а також стабільність нальоту в брахіоцефальних артеріях. Захисні ефекти антагонізму TLR2 були пов'язані з придушенням експресії прозапальних цитокінів IL-6 та TNF-α та інактивацією факторів транскрипції NF-KB та Stat3. Крім того, блокування активності TLR2 послаблює індукований стресом апоптоз макрофагальних брахіоцефальних артерій, що може сприяти вирішенню некротичних ядер при атеросклерозі, що розвивається. Крім того, дієта з високим вмістом холестерину помітно прискорює утворення атеросклерозу та збільшує експресію проапоптотичного білка CHOP та апоптозу у мишей ApoE -/- порівняно з мишами ApoE -/- Tlr2./- .

Висновок:

Фармакологічна або генетична блокада активності TLR2 зменшується та стабілізує розвинені атеросклеротичні ураження у мишей ApoE -/-. Таким чином, націлювання на передачу сигналів TLR2 може бути перспективною терапевтичною стратегією проти атеросклерозу, що розвивається.

вступ

Атеросклероз - часта причина серцево-судинних захворювань. Серцево-судинні захворювання є основною причиною смерті та є зростаючою загрозою для здоров'я людей у ​​всьому світі 1. Епідеміологічні та експериментальні дослідження встановили переважну роль запалення на всіх стадіях атеросклерозу, від утворення ранніх стабільних атеросклеротичних бляшок до запущених бляшок, які мають тенденцію до розриву 2, 3, 4, 5. Нещодавно кілька досліджень досліджували вплив фармакологічних втручань на стабільність запущених бляшок, оскільки порушення нестабільних уражень сприяє розвитку гострого коронарного синдрому 4, 6, 7. Нестійкі бляшки характеризуються великими некротичними ядрами, заповненими ліпідами, капсульованими тонкою волокнистою кришкою, високим рівнем прозапальних медіаторів та матриксних протеаз та апоптозом. Розвиток нестабільних бляшок пов'язане із залученням вродженої та адаптаційної імунної системи.

Толлоподібні рецептори (TLR) - це сімейство рецепторів розпізнавання образів, які відіграють ключову роль у вродженому імунітеті та ініціюють запальні реакції. Лігування цих рецепторів ініціює активацію ядерного фактора KB (NF-KB), в результаті чого експресується широкий спектр запальних генів 8, 9. Серед характеризуваних TLR TLR2 є унікальним завдяки своїй здатності гетеродимеризуватися з TLR1 або TLR6, що призводить до відносно широкої специфічності ліганду, що включає як ендогенні, так і екзогенні ліганди 10, 11. Слід зазначити, що всі потенційні ендогенні агоністи TLR2, включаючи біглікан, високомобільний білок хромосоми 1 (HMGB1) та окислені ліпопротеїнові компоненти, виявляються при атеросклеротичних ураженнях 12, 13, 14. Крім того, сигнальний шлях TLR2 пов'язаний із реакцією на стрес ендоплазматичної сітки (ER). Стрес ER може збільшити експресію TLR2 in vitro та in vivo, а TLR2 сприяє апоптозу макрофагів під стресом ER, викликаним ліпідом 15. Таким чином, TLR2 може бути потенційною мішенню для терапевтичних втручань при лікуванні атеросклерозу.

Матеріали і методи

Тварини та експериментальний дизайн

Мишей ApoE -/- Tlr2 -/- генерували з гетерозиготних схрещувань мишей ApoE -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона) та мишей Tlr2 -/- (фон C57BL/6, лабораторія Джексона). Генотипи гомозиготних подвійних нокаутів або мишей з одноразовим нокаутом ApoE були підтверджені за допомогою ПЛР, як описано раніше 18. Усі тварини утримувались у звичайних умовах вологості, кімнатної температури та циклів чорного світла, з доступом до води та їжі за необхідністю. Дослідження проводились відповідно до принципів, встановлених Інституційним комітетом з питань етики захисту та поводження з тваринами в процесі біомедичних досліджень (Пекін, Китай).

Збір і обробка тканин

Після того, як миші голодували протягом 4 год, з ретроорбітального венозного сплетення брали кров для вимірювання ліпідів. Потім мишей знеболювали 50 мг/кг внутрішньовенно пентобарбіталу і вливали у лівий серцевий шлуночок сольовим розчином, забуференним фосфатом, під фізіологічним тиском. Аорти швидко вирізали, миттєво заморозили від дуги аорти до роздвоєння клубової кістки і тримали при -80 ° C перед аналізом білка. Усю брахіоцефальну артерію кожної тварини фіксували у 4% параформальдегіді протягом 24 год при 4 ° C, вкладали у парафін і розрізали послідовно (товщина 5 мкм).

Біохімічний аналіз

Рівні загального холестерину в плазмі, холестерину ліпопротеїнів високої щільності (HDL-C), холестерину ліпопротеїдів низької щільності (LDL-C) та тригліцеридів визначали за допомогою комерційних наборів (Biosino, Пекін, Китай), відповідно до інструкцій виробника. .

Гістологічне та імуногістохімічне фарбування

Кожну п'яту ділянку серії фарбували модифікованим пентахромом Мовата або червоною плямою Сіріуса для оцінки складу та стабільності розвинених атеросклеротичних бляшок у брахіоцефальній артерії, а також аналізували від 12 до 15 ділянок на мишу для кожного плями. Забарвлені зрізи фотографували зі збільшенням 200 ×, і 2-3 поля зору на ділянку, що містить всю область ураження, були захоплені та проаналізовані за допомогою Image-Pro Plus 5.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Середнє значення всіх зрізів представляло атеросклеротичне ураження миші.

Для імуногістохімічного фарбування принаймні 4 ділянки брахіоцефальної артерії на мишу інкубували з антимишачими антитілами до макрофагів (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA), мишачими моноклональними антитілами проти актину гладких м’язів α-SMA, 1: 100, Санта Круз Біотехнологія, Каліфорнія, США) або антитіло до кролика проти металопротеїнази (MMP) -2 (1: 100, Abcam, Кембридж, Великобританія). Зв’язані антитіла комплексували з вторинними антитілами, зв’язаними з пероксидазою, і виявляли за допомогою діамінобензидину. Забарвлені зрізи фотографували зі збільшенням 200 ×, і 2-3 поля зору, що містять всю площу ураження на зріз, були захоплені та проаналізовані за допомогою Image-Pro Plus 5.0. Середнє значення всіх зрізів представляло експресію цільових білків при атеросклеротичному ураженні.

Для оцінки колокалізації макрофагів та гомологічного білка C/EBP (CHOP), анти-мишачого макрофагального антитіла (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) та моноклонального антитіла-миші, спрямованого проти CHOP . (1: 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) використовували як первинні антитіла. Чотири зрізи тканини на миші інкубували з міченими Alexa7 анти-мишачими кролячими анти-щурами та Alexa 488 вторинними антитілами (1: 200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Зрізи знімали за допомогою конфокального мікроскопа E2000U та оцінювали за допомогою програмного забезпечення Leica TCS SP2.

TdT-опосередкований dUTP-нікель-маркування in situ аналізів

Апоптотичні клітини при атеросклеротичних ураженнях виявляли методом фарбування TdT-опосередкованим TUNEL (dUTP), використовуючи набори (Promega, Madison, WI, USA). Ядра фарбували DAPI. Позитивні ядра в TUNEL підраховували за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа Olympus I720. Для оцінки колокалізації макрофагів макрофаги виявляли за допомогою антитіл до макрофагів миші (Mac-3, 1:50, BD, Franklin Lakes, NJ, USA), а потім `` вторинне анти-щуряче куряче антитіло з міткою Alexa 647 (1: 200, Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США).

Вестерн-ляпси

Після гомогенізації тканин екстраговані білки відокремлювали за допомогою 12% SDS-PAGE і піддавали імуноблотингу специфічними антитілами, зокрема анти-MMP-2 (Abcam, Кембридж, Великобританія), анти-фосфо -NF-KB p65, анти- NF. -KB p65, антирозщеплена каспаза-3, анти-CHOP (технологія сигналізації клітин, Данверс, штат Массачусетс, США), анти-фосфо-Stat3, анти-Stat3, анти-інтерлейкін (IL) -6, анти-IL-10 або фактор некрозу пухлини (TNF) -α (Санта Круз Біотехнологія, Каліфорнія, США). Вторинні сигнали антитіл виявляли за допомогою реактивів ECL Plus Western (Amersham Biosciences, PA, США) відповідно до інструкцій виробника.

статистичний аналіз

Дані представлені як середнє значення ± SEM. Міжгрупові порівняння були проведені з одностороннім ANOVA за допомогою SPSS. Дані, які не демонструють нормального розподілу, аналізували за допомогою U-критерію Манна-Уітні. P

Блокування активності TLR2 не впливає на рівень ліпідів у плазмі крові. Рівні загального холестерину (A), тригліцеридів (B), LDL-C (C) та HDL-C (D) визначали у мишей ApoE -/- віком 58 тижнів, які отримували фізіологічний розчин, IgG або TLR2ab iv. 18 тижнів та у мишей ApoE -/- з дефіцитом TLR2 (DK), які харчувались харчовою дієтою. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 12 мишей/група).

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Блокада TLR2 зменшує і стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки в брахіоцефальній артерії. (A та B) Фарбування Movat показало склад запущених уражень у групах, які отримували фізіологічний розчин, з IgG та TLR2ab та з дефіцитом TLR2. Стрілки вказують на ерозію засобів масової інформації. Шкала шкал представляє 200 мкм у групі A та 50 мкм у групі B. Введення TLR2ab протягом 18 тижнів та дефіцит TLR2 значно зменшують середню площу ураження (C), максимальний стеноз ураження (D), максимальну кількість некротичних ядер/бляшок ( E) та мінімальна товщина опори (F) у мишей з дефіцитом ApoE. L, просвіт; М, ЗМІ. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P

Блокування TLR2 стабілізує розвинені атеросклеротичні бляшки. У групах, які отримували TLR2ab та дефіцит TLR2, фарбування червоним кольором Сіріуса виявило збільшення вмісту колагену (A). Імуногістохімічне фарбування виявило більш рясний розподіл гладком’язових клітин (В) та зменшення накопичення макрофагів (С) при ураженнях брахіоцефальної артерії. Шкали шкали представляють 50 мкм. L позначає світло. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 10 мишей/група). b P c P

Блокування TLR2 пригнічує запалення судин в атеросклеротичних артеріях. Експресія MMP-2 (A і B), фосфорилювання NF-κB p65 (C), фосфорилювання Stat3 (D) та експресія цитокінів IL-6, TNF-α та IL-10 (E) були знижені у оброблених TLR2ab та дефіцит TLR2. Шкали шкали представляють 50 мкм. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 6 мишей/група). b P

Дієти з високим вмістом холестерину (HC) збільшують експресію TLR2 у макрофагах, а блокада TLR2 зменшує індуковану HCl експресію CHOP та апоптоз при атеросклеротичних ураженнях. (A) Забарвлення Моват виявило морфологію нальоту в брахіоцефальних артеріях мишей ApoE -/- Tlr2 +/+ та ApoE -/- Tlr2 -/-. Шкали шкали представляють 200 мкм. Дефіцит TLR2 значно зменшив середні пошкоджені ділянки (B) та розмір некротичних ядер (C) (n = 8 мишей/група). (D) Подвійна імунофлуоресценція виявила інфільтрацію макрофагів, що експресують TLR2, у ураження брахіоцефальних артерій 12-24-тижневих мишей ApoE -/-, яких розміщували на атерогенних дієтах з 6 тижнів. Шкали шкали представляють 20 мкм. У зазначених віках миші ApoE -/- Tlr2 -/- демонстрували значно знижену експресію CHOP (E), Bcl-2 (F) та розщепленої каспази-3 (G) в аортах. Дані представлені як середнє значення ± SEM (n = 4–6 мишей/група). b P -/- того ж віку. e P -/- 12 тижнів на дієті Чау.

Повнорозмірне зображення

  • Завантажте слайд PowerPoint

Обговорення

Запальні процеси відіграють центральну роль у розвитку атеросклерозу. Показано, що TLR2 бере участь у цьому процесі 11, 27. Відповідно до попередніх досліджень на ранніх стадіях атеросклерозу, блокування активності TLR2 зменшує інфільтрацію макрофагів нальоту; експресія медіаторів запалення, зокрема MMP-2, TNF-α та IL-6; та інактивація фактора транскрипції NF-KB 20, 21, 23. Крім того, антагонізм TLR2 також пригнічував експресію імунодепресивних медіаторів IL-10 та фактора транскрипції Stat3, вказуючи на те, що переваги блокади TLR2 залежать від значного гальмування запалення. Це дослідження пропонує перші докази TLR2-індукованого запалення при запущених ураженнях, яке доповнює раніше виявлену роль TLR2 у ранньому атеросклерозі.

Важливою особливістю поширеного атеросклерозу є нестабільність нальоту. Хоча механізми, що лежать в основі розриву нальоту, залишаються незрозумілими, багато факторів сприяли цьому процесу, включаючи накопичення макрофагів, високий рівень прозапальних медіаторів, надмірну активацію ММР та апоптоз VSMC та макрофагів. На додаток до регуляції запальних реакцій, ми спостерігали, що блокада TLR2 зменшує апоптоз макрофагів за допомогою аналізу TUNEL та імунофлюоресценції.

Підводячи підсумок, ми продемонстрували, що інактивація гена TLR2 у мишей ApoE -/- зменшує розмір бляшок та підвищує стабільність бляшок у брахіоцефальній артерії під час запущеного атеросклерозу після гальмування запалення та викликаного стресом апоптозу макрофагів. Зокрема, лікування цих мишей нейтралізуючим антитілом TLR2 викликало терапевтично сприятливі ефекти і може становити перспективну терапевтичну стратегію проти атеросклерозу, що розвивається. Оскільки для ініціювання захворювання необхідна підвищена експресія TLR2 на ендотеліальних клітинах, TLR2 може опосередковувати або посилювати викликані стресом апоптотичні сигнали ER при поширених атеросклеротичних ураженнях. Наша робота припускає, що фармакологічна блокада передачі сигналів TLR2 є привабливим підходом для майбутнього лікування атеросклерозу.

Внесок автора

Xiao-xing WANG та Zhuo-wei HU розробили дослідження; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV та Hui-min YAN сприяли розробці методології; Xiao-xing WANG, Xiao-xi LV, Jia-ping WANG, Hui-min YAN, Zi-yan WANG, Han-zhi LIU та Xiao-ming FU проводили експерименти; Xiao-xing WANG та Zhuo-wei HU проаналізували дані та написали документ.