Дефіцит каспази-2 покращує споживання вуглеводів у всьому організмі та запобігає ожирінню

дефіцит

  • Теми
  • Анотація
  • Головна
  • Результати
  • дефіцит в каспаза-2 зміщує споживання палива у всьому тілі в бік підвищеного окислення вуглеводів
  • дефіцит в каспаза-2 захищає від ожиріння, гіперліпідемії, жирової хвороби печінки та інсулінорезистентності, спричиненої HFD
  • Зміни у споживанні палива у всьому організмі зберігаються у мишей Casp2-/- подається на HFD
  • Порушення метаболізму печінки та скелетних м'язів не впливає на вибір палива в Росії Casp2 миша-/-
  • Casp2-/- миші не демонструють змін у експресії генів, пов'язаних з резистентністю до інсуліну в gWAT
  • Casp2-/- миші знижували смерть білих жирових клітин, спричинену HFD
  • Дефіцит каспази-2 підвищує HFD-індуковане побуріння gWAT
  • Обговорення
  • Матеріали і методи
  • Дослідження на тваринах
  • Метаболічне фенотипування
  • Біохімія тканин і сироватки крові
  • IPGTT, IPITT та резистентність до інсуліну
  • МРТ-аналіз складу тіла
  • QPCR в реальному часі
  • Імуноблот
  • Гістологія та ТУНЕЛЬ
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • Додаткові цифри
  • Файли Excel
  • Додаткові рисунки Легенди та таблиця

Теми

  • Енергетичний обмін
  • Гомеостаз
  • Гідролази
  • Ожиріння

Анотація

Головна

У цьому дослідженні ми проводили метаболічний моніторинг за допомогою непрямої калориметрії та дієти з високим вмістом жиру (HFD) (60% кДж жиру) для подальшого вивчення ролі каспази-2 in vivo у метаболізмі. Ми показуємо, що дефіцит каспази-2 захищає від розвитку ожиріння, НАЖХП та резистентності до інсуліну, спричинених ВЧС. Наші дані вказують на те, що каспаза-2 є важливим регулятором гомеостазу глюкози та метаболізму базальної енергії, і що вона відіграє певну роль у модулюванні біології адипоцитів та розширенні жиру.

Результати

Дефіцит каспази-2 зміщує споживання палива в організмі в бік підвищеного окислення вуглеводів

Для подальшого дослідження ролі каспази-2 в метаболізмі ми оцінили метаболічний фенотип молодих мишей Casp2 -/-. У віці 4 тижнів (1 тиждень після відлучення) миші Casp2 -/- та дикого типу (WT), які годували стандартною лабораторною дієтою (SLD; 18% кДж від жиру), демонстрували масу тіла, достатнє харчування, рух та витрата енергії та харчова поведінка (рисунок 1а, додатковий малюнок S1). Непряма калориметрія виявила значне збільшення виробництва VCO 2 (рисунок 1c) у мишей Casp2 -/-, але споживання VO 2 було порівняно із споживанням мишей WT (малюнок 1b). Коефіцієнт дихання (RQ), який представляє використання вуглеводів або жиру для палива, був значно вищим у мишей Casp2 -/- (Малюнок 1г). Це вказує на те, що дефіцит каспази-2 призводить до зміни споживання палива у всьому тілі в бік підвищеного окислення вуглеводів.

Аналіз експресії генів печінкової тканини мишей WT та Casp2 -/-, що харчуються SLD та HFD. Виявлено, що експресія генів, які, як відомо, беруть участь у жировій печінці, суттєво змінена (кратна зміна порівняно з мишами WT, що годували SLD> 1, 2 та P -/- порівняно з контролем WT, виміряне за допомогою внутрішньоочеревинного тесту на толерантність до глюкози (IPGTT) і тест на толерантність до інсуліну (IPITT) (малюнки 2i та j). Через 12 тижнів (17 тижнів) рівень глюкози в крові натще був значно нижчим у Casp2 - мишей./- годували SLD та HFD (малюнок 2k) Це виявилось незалежним від інсуліну, оскільки рівень інсуліну в плазмі натще не відрізнявся між мишами WT, які годувались SLD та мишами Casp2 -/- (Малюнок 2k). Крім того, у мишей Casp2 -/- не розвинулася гіперінсулінемія або індукована резистентністю до інсуліну, спричинена HFD, як це продемонструвала оцінка гомеостазу значення резистентності. 'інсулін (HOMA-IR) (Малюнок 2k).

У сукупності ці результати вказують на те, що каспаза-2 бере участь у підтримці розміру, функції та гомеостазу глюкози адипоцитів, і що дефіцит каспази-2 може поліпшити жирову функцію та захистити від ожиріння, НАЖХП та жирової печінки, індукованої HFD. Крім того, дані вказують на те, що фенотип мишей Casp2 -/-, яких годували HFD, не був результатом недостатнього зберігання ліпідів, а зміненого використання ліпідів та/або метаболізму в адипоцитах.

Зміни використання палива у всьому тілі зберігаються у мишей Casp2 -/-, що харчуються HFD

Підвищений рівень використання вуглеводів зберігається у мишей Casp2 -/-, які харчуються SLD або HFD. Метаболічний моніторинг за допомогою непрямої калориметрії проводили на 13-тижневих мишах WT та Casp2 -/- після 8 тижнів годування SLD або HFD ad libitum. ( в ) Вага тіла, загальне щоденне споживання їжі, активність (рух) та енергетичні витрати (ЕЕ). ( ) Споживання VO 2 ( проти ) Виробництво VCO 2 та ( d ) Визначення RQ протягом 24 годин з 12-годинними циклами світло-темрява. Значення - це середнє значення ± SD (стовпчасті графіки) і означає ± SEM (графіки розсіяння) (n = 10-12 на групу). Порівнювали порівняння між дієтами кожного генотипу (дієтичний ефект) та між генотипом кожної групи продуктів харчування (ефект генотипу). Статистична значимість, позначена * P # P -/-

Аналіз експресії генів скелетної м'язової тканини мишей WT та Casp2 -/-, що харчуються SLD та HFD. ( в ) Експресія генів, що беруть участь у метаболізмі глюкози/глікогену, визначена як суттєво змінена за допомогою дієти або генотипу, виміряна за допомогою масиву qPCR на 84 генах метаболізму глюкози. Значеннями є середні зміни суттєвих відмінностей (t-тест, n = 3–4 на групу, Р -/- годується СЛД або ЧСЧ протягом 12 тижнів. ( d ) qPCR, що використовується для вимірювання експресії генів, що беруть участь у поглинанні та окисленні жирних кислот (n = 5-6 на групу). Значення є середніми ± SD Статистична значимість, показана як * P -/- миші не демонструють змін у експресії генів, пов'язаних з резистентністю до інсуліну в gWAT

Оскільки розмір клітин адипоцитів позитивно корелює з непереносимістю глюкози та гіперінсулінемією у людей із ожирінням, 24 ми досліджували експресію гена gWAT на панелі генів, що беруть участь в резистентності до інсуліну. Харчування HFD змінило експресію великої кількості генів у мишей WT, але не у мишей Casp2 -/-, що призвело до великої кількості значущих відмінностей між генотипами HFD (рис. 6а та додаткові дані S3). У мишей WT HFD знижував експресію 41/84 генів, багато хто брав участь у засвоєнні глюкози, передачі сигналів інсуліну в метаболізмі ліпідів та збільшенні експресії 6 з 84 генів, тоді як у мишей Casp2 -/- HFD модифікував експресію лише з 13 проаналізованих генів (рис. 6а). Єдиною суттєвою різницею, яку спостерігали між мишами, які годували SLD, було збільшення експресії Nampt та Pdk2 у мишей Casp2 -/- порівняно з контролем WT (рис. 6а).

Аналіз експресії гена резистентності до інсуліну у gWAT та апоптозу адипоцитів у мишей Casp2 -/-, які годували HFD. Виявлено, що експресія генів, які, як відомо, беруть участь в резистентності до інсуліну, суттєво змінена (кратна зміна порівняно з мишами WT, що харчуються SLD> 1, 2 та P 25. Дійсно, у атрибутів WT мишей, які харчувались кількома адипогенними генами, включаючи PPARγ та FABP4 HFD, але не у мишей Casp2 -/- (рис. 6а). Ці відмінності підтверджені аналізом qPCR, як і відмінності у експресії Glut4 та PPARa (рис. 6b). інфільтруючих макрофагів Cxcr4, Adgre1 та Ccr5 (рис. 6а).

Миші Casp2 -/- зменшували загибель білих жирових клітин, спричинену HFD

При ожирінні запальна інфільтрація виникає у відповідь на посилення апоптотичної загибелі клітин адипоцитів і є ключовим фактором патогенезу ожиріння. 26 Оцінка апоптозу за допомогою TUNEL показала подвоєння кількості відмираючих білих адипоцитів, позитивних на TUNEL, у gWAT мишей WT, які годувались HFD, порівняно з контролем WT, що годувались SLD та мишами Casp2 -/-, які годували HFD (рис. 6c). ). Важливо, що не було різниці в загибелі жирових клітин між мишами WT, які годувались SLD та мишами Casp2 -/-, що вказує на ймовірне значення неапоптотичної ролі каспази-2 в біології адипоцитів.

Смерть бурих жирових клітин також сприяє патогенезу ожиріння, знижуючи термогенну активність НДТ. однак ніякої різниці між генотипом та дієтою не спостерігалось (додаткова фігура 3а). Імуноблот-аналіз виявив очевидне зниження про-каспази-3 у мишах gTW та iBAT у мишей WT, які годувались HFD, але різниці не виявлено у розщепленій каспазі-3 (рис. 6d та рис. 3b додатково). Каспаза-2 була асоційована з ліпоапоптозом 27, і припускають, що це може бути причетним до загибелі клітин адипоцитів після їх харчування західною дієтою. Однак ми не спостерігали жодної різниці між рівнями білка повної каспази-2 та виявленням продуктів її розщеплення в рецепторах gWAT та iBAT у мишей WT, які годували HFD (дані не наведені).

Дефіцит каспази-2 підвищує HFD-індуковане побуріння gWAT

Обговорення

Змінене використання субстрату у мишей Casp2 -/- ідентифікується за зміщенням значення RQ. Незважаючи на те, що зміна RQ, хоча і дуже значне, виявляється незначним, воно є фізіологічно важливим, оскільки це не короткочасна зміна, така як короткий період фізичних вправ, а ефект більш стійкий, вже наявний відразу - відлучення Миші Casp2 -/-, які можуть мати довгострокові фізіологічні результати. Крім того, добре встановлено, що адаптація до впливу HFD вплине на значення RQ і що ця величина у людини знаходиться в межах 0,03,35, що менше різниці, що спостерігається у людей. Миша Casp2 -/-. .

Дефіцит каспази-2 призводить до підвищеної сприйнятливості до пошкоджень, спричинених окислювальним стресом, та фенотипу легкого передчасного старіння. 11, 15 Крім того, метаболізм глюкози зазвичай регулюється у відповідь на збільшення потреби в енергії. Тому ми пропонуємо, щоб глобальна делеція каспази-2 змінювала метаболічні шляхи, що призводить до легкого енергетичного стресу. У свою чергу, це збільшує потребу в енергії, що призводить до адаптивного ремоделювання, який обумовлює фенотип мишей Casp2 -/-. Це пояснювало б, чому дефіцит каспази-2 призводить до сприятливого гомеостазу глюкози та захисту від ожиріння, спричиненого HFD, парадоксально збільшуючи їхню сприйнятливість до окислювального стресу та передчасного старіння. Тепер будуть потрібні подальші дослідження для визначення тканиноспецифічної ролі каспази-2, щоб допомогти з’ясувати його точний молекулярний механізм.

На закінчення ми показали, що каспаза-2 є власним медіатором метаболізму базальної енергії. Крім того, ми надаємо додаткові докази, що підтверджують пряму роль каспази-2 у біології адипоцитів, розширенні жиру та його потенціалі як терапевтичної мішені при лікуванні ожиріння та метаболічних захворювань. Хоча наші висновки демонструють, що механізм каспази-2 в метаболізмі, ймовірно, включає неапоптотичні функції, залишаються важливі питання щодо того, якими є субстрати каспази-2 та чи метаболічна функція повністю не залежить від функції каспази-2 у зростанні арешт і апоптоз клітин, що несуть мітотичні аберації. 32, 39

Матеріали і методи

Дослідження на тваринах

Метаболічне фенотипування

Метаболічні вимірювання (споживання їжі, рухова активність, споживання VO 2 та вироблення VCO 2) були отримані за допомогою метаболічної системи фенотипування Promethion (Sable Systems, Лас-Вегас, штат Невада, США). Мишей утримували в системі «Прометіон» протягом 48–72 год з вільним доступом до їжі та води. Моніторинг проводили протягом 24–48 год після акліматизації мишей до клітин протягом 6–12 год. RQ розраховували як відношення VCO 2/VO 2 з RQ = 0,7, що вказує на окислення чистого жиру, і RQ = 1,0, що вказує на чисте окислення вуглеводів.

Біохімія тканин і сироватки крові

Тригліцериди плазми вимірювали за допомогою автоматизованого аналізу (CSIRO, Adelaide, SA, Австралія). Рівні інсуліну та лептину у плазмі крові вимірювали за допомогою набору ELISA для інсуліну Щур/Миша (кішка # EZRMI-13 K) та Набору ІФА для мишачого лептину (кішка # EXML-82 K; Millipore, Бедфорд, Массачусетс, США). Глікоген та FFA у скелетних м’язах та тканинах печінки визначали за допомогою комерційно доступних наборів аналізів (BioVision, Milpitas, CA, США; Sigma, St. Louis, MO, USA).

IPGTT, IPITT та резистентність до інсуліну

Тестування на толерантність до глюкози та інсуліну проводили після внутрішньочеревної ін’єкції 1 г/кг глюкози або 0,5 ОД/кг інсуліну/кг відповідно, після 6-8-годинного голодування, як описано раніше. 8 HOMA-IR (HOMA-IR = інсулін у плазмі натще × глюкоза в крові натще/22,5), що відображає резистентність до інсуліну, розраховували з рівня глюкози в крові натще і рівня інсуліну, виміряних після 12 тижнів годування HFD, використовуючи iHOMA2, версія 8.82.R2. 40

МРТ-аналіз складу тіла

Жир і худою масу всього тіла визначали за допомогою градієнтного ехо-сигналу, зваженого 3D T 1, отриманого за допомогою настільної системи МРТ (Bruker Icon 1T; Bruker Physik GmbH, Еттлінген, Баден-Вюртемберг, Німеччина) у мишей 17-тижневого віку, знеболених з ізофлураном. ITK snap (www.itksnap.org) був використаний для подальшої сегментації сканувань.

QPCR в реальному часі

Для стандартного qPCR загальну РНК витягували із замороженої тканини, зворотну транскрипцію виконували, як описано раніше. 9 Експресія гена нормалізувалась для ведення домашнього господарства (β -актин або ТАТА-зв’язуючий білок), а потім виражалася як кратна зміна SLD-годували мишей WT за допомогою методу 2 -ΔΔCT. Послідовності праймерів наведені в додатковій таблиці S1.

Для аналізу PCR-масиву RT 2 Profiler (Qiagen/SA Biosciences, Валенсія, штат Каліфорнія, США) було проведено синтез кДНК першої ланцюга із загальної РНК за допомогою набору синтезу кДНК RT 2 First (Qiagen). Система ПЛР RT 2 Profiler була створена, запущена та проаналізована на ПЛР-системі Viaa 7 у реальному часі (Thermo Fisher Scientific Inc., Вілмінгтон, Делавер, США) відповідно до інструкцій виробника. Використані масиви ПЛР RT 2 Profiler: жирова печінка миші (# PAMM-157Z); метаболізм глюкози у мишей (# PAMM-006Z); мишача резистентність до інсуліну (# PAMM-156Z, Qiagen/SA Biosciences). Списки генів та функціональне групування наведені в Додаткових даних S1-S3. ПЛР-масиви мали формат 96 × 4, що дозволяло запускати чотири незалежні вибірки на кожному масиві. Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis версії 3.5, онлайн-програмне забезпечення (//pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php).

Імуноблот

Білки виділяли з тканин, розщеплювали SDS-PAGE, а потім переносили на мембрану PVDF, як описано раніше. 8 мембран іммуноблотували первинними антитілами, специфічними до: каспази-3 (клон 8G10, # 9665), розщепленої каспази-3 (# 9664) та р53 (клон 1C12, # 2524; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA); UCP1 (# ab10983; Abcam, Кембридж, Массачусетс, США); і клон β -актину AC-15 (# A5441; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Денситрометричний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення Image J (NIH, Bethesda, MD, USA).

Гістологія та ТУНЕЛЬ

Використовували стандартні методи фарбування гематоксиліном/еозином тканин, зафіксованих у HistoChoice (Sigma-Aldrich). Фарбування TUNEL та кількісне визначення апоптотичних клітин проводили, як описано. 13

статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism (v 6.0, Сан-Дієго, Каліфорнія, США). Дані виражаються як середнє значення ± SD або середнє значення ± SEM. Для парних порівнянь використовували двосторонній непарний t-тест із поправками Welch. Для багатогрупових порівнянь використовувався односторонній або двосторонній ANOVA для пост-тестування Tukey, якщо не вказано інше. Значення P