Еволюційні зміни у застосуванні окисно-відновних амінокислот та їх причини - PDF Безкоштовно
Еволюційні зміни у використанні окисно-відновних амінокислот та їх причини Еволюційна мінливість у використанні амінокислот RedoxActive: причини та наслідки 20 грудня 1978 р. У Родальбені ад Родальб Майнц, 2014
Декан: 1-й рецензент: 2-й рецензент: День усного іспиту: 03.06.2015
Зміст Список скорочень. IV 1 Вступ. 1 1.1 Окислювальний стрес. 1 1.2 Мітохондрії. 1 1.2.1 Будова та функції. 2 1.2.2 Мітохондріальний дихальний ланцюг та окисне фосфорилювання. 4 1.2.3 Відхилення від універсального генетичного коду. 11 1.3 Теорія вільних радикалів старіння. 12 1.3.1 Реактивні форми кисню. 12 1.3.2 Мітохондріальна теорія вільних радикалів старіння. 14 2 Питання та цілі. 17 3 матеріал. 18 3.1 Записи даних про білки. 18 3.1.1 Тривалість життя, маса тіла та послідовності білків досліджуваних видів тварин. 18 3.1.2 Білкові послідовності людини в окремих компартментах. 20 3.1.3 Ядерні та мітохондріально закодовані субодиниці комплексів дихальних ланцюгів. 21 3.2 Комп’ютерні програми та програмні пакети. 21 3.3 Спеціальні хімічні речовини. 21 3.4 Список пристроїв. 22 3.5 Клітинна культура. 23 3.5.1 Клональні клітини. 23 3.5.2 Первинні клітини. 23 3.6 Середовища та розчини для культури клітин. 23 3.7 Розчини для біохімічних та клітинних біологічних аналізів. 24 3.8 Буфери та розчини для аналізу білків та ліпідів. 24 3.9 Антитіла. 27 4 Методи. 29 4.1 Біоінформаційний аналіз. 29 4.1.1 Частота використання амінокислот у білкових послідовностях. 29 4.1.2 Ідентифікація ділянок мембрани. 29 4.2 Культура клітин. 29 4.2.1 Визначення віку клітин клітин IMR90. 29 І.
Список скорочень 2SH меркаптоетанол 4SH 1-бутантіол 8SH 1-октантіол 10Ш 1-декантіол 12SH 1-додекантіолом 14SH 1-tetradecanethiol 18SH 1-octadecanethiol ABAM змішувати антибіотик протигрибкової суміші аміачного ammonate, АХЕ ацетилхолінестеразою А.А. catalanethiol, АХЕ ~ D, ацетилхолінестерази А.А., АХЕ ~ D, ацетилхолін трифазний, АХЕ ~ D, ацетилхолін трифазний, АХЕ ~ D, ацетилхолін трифазний, АХЕ ~ D, ацетилхолін трифазний, АХЕ ~ D, catalosulphase, АХЕ ~ D, catalosulphase, АХЕ ~ D, ацетилхолін трифазний, АХЕ ~ D, catalosulphase, АХЕ ~ D, aacetylcholine трифазного, АХЕ ~ D, catalosulphase, а. каталаз СМ цистеїн ddH2O двічі дистильована воду з модифікованої середовища Голки DMS Dodecylmethylsulfid ДМСО диметилсульфоксид ДНК 3-меркаптопропіоновая кислоти DHA докозагексаєнової кислоти DMEM Дульбекко дезоксирибонуклеїнової кислоти DOH 1-додеканол фосфатно-сольового буферного CstF фактор стимуляції розщеплення DPBS Дульбекко ДТТ дітіотреїтолу ЕДТ етилендіамінтетраоцтова ЕР ендоплазматичного ретикулум перенесення ЄФТ електронного кільце флавопротеїдів EtOH етанол FBS/FCS фетальна бичача/теляча сироватка, фетальна бичача сироватка FMN флавін мононуклеотид GRase глутатіонредуктаза IV
GSH глутатіон GPX глутатіонпероксидаза год год (и), год. (Год.) H2O2 перекис водню HRP пероксидаза хрону, пероксидаза хрону MAM мітохондрії, пов'язані ER мембрана MEM NEAA Мінімальна необхідна середа, Неефіційні амінокислоти MTS мітохондріальна хвилинна міграція Мітохондріальна цільова послідовність mtdna Мітохондріальна дезоксирибонуклеїнова кислота Msr метіонінсульфоксидредуктаза МТТ 3- (4,5-диметилтіазоліл-2) -2,5-дифенілтетразолію бромід MUFA (и) мононенасичені жирні кислоти, мононенасичені жирні кислоти, мм мілімедіамоль мкм міліметрів NADPH нікотинамід аденин динуклеотид фосфат NOX NADPH оксидаза NaN3 азид натрію нм нм нанометр Oxa1 мітохондріальна оксидаза збірка білок 1 PAGE поліакриламід гель електрофорез PD подвоєння PUFA (s) поліненасичені жирні кислоти (кислоти), кімнатна температура, полінуклеати, вуглеводнева кислота, рибоядерний ядер активні форми кисню, реактивні Sa ustoffspies SDS додецилсульфат натрію, додецилсульфат натрію SOD супероксиддисмутаза SRP розпізнавання сигналу частинка V
t12sh tert-dodecanethiol TBARS реакційноздатні речовини тіобарбітурової кислоти, реакційноздатні речовини тіобарбітурової кислоти TEMED N, N, N ', N'-тетраметилетилендіамін TFA транс-жирні кислоти, транс-жирні кислоти TM трансмембранний TOC α-токоферол, вітамін E TOM транслока кислоти зовнішньої мембрани trnacle Тіоредоксин TWEEN полісорбат VDAC, залежний від напруги аніонний канал VI
Вступ Рисунок 5: Огляд реакцій активних форм кисню та нітротипів у мітохондрії та їх наслідки. Адаптовано за Smith et al., 2003. Токсичність супероксиду в мітохондріальному матриксі може бути вивчена у митохондріальних мишей-нокаутів Mn-SOD, які виживали лише між 10 і 20 днями навіть у присутності антиоксидантів (Lebovitz et al., 1996; Li et al., 1995). На противагу цьому, вибивання цитозольного Cu/Zn-SOD не є смертельним, хоча ці тварини демонструють дещо підвищену чутливість до АФК (Ho et al., 1998), що свідчить про те, що екстрамітохондріальний супероксид менш токсичний. Характерним фактором накопичення протягом усього часу білків та ліпідів, пошкоджених окисленням, є суворо вікова поява ліпофусцину, нерозкладається зберігання ліпофільних, агрегованих білків (30-58%) та ліпідів (1951%) у постмітотичних клітинах (Porta, 2002). Ліпофусцин особливо сильно зустрічається в серцевому м’язі та нервових клітинах, а також у пігментному епітелії сітківки. Підсумовуючи, ця теорія може пояснити прогресивний шлях старіння наступним чином: У процесі старіння окислені білки постійно накопичуються. Окислення 16
Матеріал 5 мл пірувату (100 мм) 5 мл MEM NEAA (100 мм) 3,7 Розчини для біохімічних та клітинно-біологічних досліджень Розчин МТТ (3- (4,5-диметилтіазоліл-2) -2,5-дифенілтетразолію бромід: 5 мг/мл МТТ у розчині солюбілізації МДТ ddh2o: 40% (мас./об.) диметилформамід 10% (мас./об.) додецилсульфат натрію рН 4,0 (крижана оцтова кислота) 3,8 буфери та розчини для аналізу білків або ліпідів 10-кратний сольовий розчин, забуференний фосфатом (PBS): 1,37 М NaCl 27 мм KCl 100 мм Na2HPO4 x H2O 18 мм KH2PO4 ph 7,4 Фосфатно-сольовий розчин з TWEEN-20 (PBS-T): 1x PBS 0,05% (об/об) TWEEN-20 ph 7.4 Буфер збору клітин (буфер лізису) без SDS: 24
Матеріал 50 мм Трис-HCl 10% сахарози 1 мм EDTA 1 мм EGTA 15 мм HEPES 1 мм ортованадат натрію 1 мм Інгібітор протеїнази NaF 1: 100 (Sigma-Aldrich) інгібітор фосфатази 1: 100 (Sigma-Aldrich) ph 6,8 4x буфер завантаження (Зразок буфера) для SDS-PAGE: 200 мМ трис-HCl, рН 6,8 8% (мас./Об.) SDS 40% (мас./Об.) Гліцерин 0,02% (мас./Об.) Бромофенол синій 20% (об./Об. v) β-меркаптоетанол 10-кратний запущений буфер для SDS-PAGE: 250 мМ трис основа 2,5 M гліцину 1% (мас./об.) SDS pH 8,3 розділювальний гель для SDS-PAGE: 0,375 M Tris-HCl, pH 8, 8 10% (мас./Об.) Акриламід/бісакриламід (29: 1) 0,1% (мас./Об.) SDS 0,05% (об./Об.) TEMED 25
Матеріал 0,1% (мас./Об.) Гель для укладання APS для SDS-PAGE: 0,15 М Трис-HCl, pH 6,8 3% (мас./Об.) Акриламід/бісакриламід (29: 1) 0,1% ( w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (w/v) APS 10x буфер перенесення: 250 mm Tris основа 2,5 M гліцин Додавання 20% метанолу до 1x розведення 1x Ponceau S.: 0,2% (мас./Об.) Понсо S 5% (об./Об.) Оцтової кислоти, що блокує буфер: 5% (мас./Об.) Сухого сухого молока (знежиреного) у PBS-T Невідновлювальний ліпідний буфер (дегазований): 20 мм TRIS, р 7,4 1 мм MgCl2 5 мм KCl 26
Матеріальний буфер для аналізу жирних кислот: 1x PBS 10 мкм фенотіазину 1 мм DTT 1 мм EDTA Розчини для проявлення люмінолу: A: 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6 0,025% люмінолу B: 0,11% пара-кумарової кислоти в DMSO C: 30% аналіз H2O2 TBARS Стоп-розчин: 5% трихлороцтова кислота в 1 М крижаній оцтовій кислоті 0,5% тіобарбітурова кислота в 10 мМ NaOH 3,9 Антитіла Використані антитіла розбавляли в PBS-T до концентрацій, наведених нижче. Крім того, до первинних антитіл додавали 0,05% азиду натрію (NaN3). Виробник антитіл анти-hsp70 (1: 1000) ген стресу, США анти-hsp90 (1: 1000) ген стресу, США анти-p21 (1: 500) BD Biosciences, США анти-p53 (1: 1000) Abcam, США анти-p62 (1: 500) Санта Круз Біотехнологія, США проти поліубіквітину (1: 1000) Dako, Данія проти тубуліну (1: 1000) Sigma-Aldrich, Німеччина Таблиця 6: Первинні антитіла 27
Виробник матеріальних антитіл Esel anti-mouse-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, США Esel anti-rabbit-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Таблиця 7: Вторинні кон'югати антитіл-HRP 28
Результати Рисунок 7: Співвідношення розподілу амінокислот між пероксисомними та клітинними білками у 4 видів (зліва направо: Homo sapiens, Bos taurus, Mus musculus, Rattus norvegicus). 5.1.2 Порівняння мітохондріальних та клітинних білків Співвідношення використання амінокислот у білках, кодованих мітохондріями, порівняно із клітинними білками або білками, кодованими мітохондріями, порівняно з білками, що локалізовані в мітохондріях, було використано як дві та три моделі (рис. 8 та рис. 9). Деякі особливості мітохондрії полягають у тому, що він вважається основним місцем виробництва окислювальних видів кисню (Brand, 2010), і що в мітохондріально кодованих білках комплексу I окислювально-відновна-активна амінокислота цистеїн виснажується залежно від тривалості життя (Schindeldecker et al., 2011), тоді як там також збагачується окисно-відновно-відновний метіонін незалежно від максимальної тривалості життя (Bender et al., 2008). Це робить мітохондрію видатною моделлю, за допомогою якої можна вивчати еволюційні пристосування до окисного стресу та результуючу диференційовану частоту використання амінокислот. 39
Результати Використання KLMNPQRSTVWY Аеробність (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 Таблиця 12: Модель V: Частота використання амінокислот у мітохондріально кодованих білках дихального ланцюга у вільному проживанні, аеробні проти паразитарних, анаеробні гельмінти. (односторонній, непараметричний дисперсійний аналіз з двома категоріями). * Термін раціон описує співвідношення середніх значень. Якщо порівняти диференційоване використання амінокислот у мітохондріально закодованих білках дихального ланцюга між аеробними та анаеробними хробаками, помітно, що цистеїн демонструє найбільші середні зміни у формі виснаження (табл. 12). Однак найвищу значимість виявляє гістидин, який, отже, зумовлений низьким розкидом точок даних. Частота використання метіоніну, з іншого боку, показує високий розкид у досліджуваних видах тварин, що в поєднанні з великим середнім відхиленням забезпечує середню статистичну значимість. Оскільки дисперсія амінокислоти валіну невелика, це призводить до найбільш суттєвих змін у цій моделі. 49
Результати окислюваного субстрату, який інгібує або уповільнює його окислення (Halliwell, 1990). Слід зазначити, що крім окислюваних амінокислот, цукор, ДНК та ліпіди можуть також служити субстратами. Особливо цікаво, що метіонін накопичується в білках внутрішньої мітохондріальної мембрани, що біологічно спричинено наявністю двох кодонів метіоніну в кодованих мітохондріями білках дихального ланцюга. Було висловлено гіпотезу про те, що накопичення метіоніну в цих білках та пов'язане з цим подвоєння кодону метіоніну в мітохондріальній ДНК є причинно-наслідковим внаслідок продукування та збільшення кількості АФК у цій органелі або компартменті (Bender et al ., 2008). Тому було цікавим дослідити використання метіоніну в різних відділеннях або областях людської клітини, щоб визначити, чи можна знайти топологічно специфічну частоту при використанні цієї амінокислоти. В результаті послідовності білків людини з різних субклітинних ділянок аналізували на вміст метіоніну. 52
Результати 5.2.1 Порівняння використання метіоніну в різних субклітинних зонах Рисунок 10: Використання метіоніну в білках людини в різних субклітинних областях. Кожна вертикальна лінія символізує окремий білок, положення якого відповідає рангу використання метіоніну на кривій розподілу, показаній нижче. Зелені лінії означають відповідне середнє значення, червоні - відповідну медіану вживання метіоніну у досліджуваних відділеннях. Суцільна вертикальна лінія позначає глобальну медіану всіх послідовностей білка, досліджених у 19806 році. На рисунку 10 показано статистичний розподіл метіоніну в білках людини в різних субклітинних областях. Наступні скорочення використані на малюнку 10 та в таблиці 14 53
Результати Порівняння чотирьох дихальних комплексів ланцюгів I, III, IV та V, в яких субодиниці походять як з ядра, так і з самого мітохондрію, також показує різну частоту використання метіоніну. В середньому комплекс I складається з 5,84% метіоніну у всіх досліджених видів тварин, 2,64% у тварин з одним кодоном Met і 6,82% метіоніну у тварин з двома кодонами Met; Комплекс III у цілому від 3,79% метіоніну, у тварин з одним кодоном Met від 2,30% та у тварин з двома кодонами Met від 4,24% метіоніну. Комплекс IV у цілому від 4,72%, у тварин з одним кодоном Met від 3,42% та у тварин з двома кодонами Met від 5,11% метіоніну; Комплекс V у всіх видів тварин від 5,31%, у тварин з одним кодоном Met від 3,17% та у тварин з двома кодонами Met від 5,97% метіоніну. Найбільша різниця в різних комплексах може спостерігатися в комплексі I. Існує різниця у частоті вживання метіоніну 4,18% між тваринами з одним кодоном Met та тваринами з двома кодонами Met. 60
Результати Рисунок 12: Швидкість виживання клітин HT22 після інкубації з 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм та 200 мкм CAM, DES, CYS та GSH протягом 72 годин (n> = 3). Водорозчинні речовини CAM, DES, CYS та GSH, використані на фіг.12, не виявляють токсичного впливу на клітини HT22 при будь-якій концентрації, що використовується після інкубації протягом 72 годин. Рисунок 13: Швидкість виживання клітин HT22 після інкубації з 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм та 200 мкм 2SH, 4SH, 8SH та 12SH протягом 72 годин (n> = 3). Після інкубації клітин НТ22 з ліпофільними речовинами 2SH, 4SH, 8SH та 12SH протягом 72 годин було виявлено диференційовану токсичність. Зі збільшенням концентрації токсичність всіх речовин зростає. Токсичний ефект найбільш виражений при 12SH, потім при 8SH, 4SH та 2SH. Отже, токсичність корелює з довжиною алкільного ланцюга та концентрацією 62
Результати: концентрація не впливала на токсичну дію. Тільки CAM показав низьку концентрацію токсичної токсичності через 72 години. Малюнок 15: Виживання клітин клітин IMR90 (PD 28.1) після 72 годин інкубації з 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм та 200 мкм 2SH, 4SH та 8SH (n> = 3 ). Після 72 годин обробки клітин IMR90 дедалі ліпофільнішими речовинами 2SH, 4SH та 8SH спостерігалась також низька токсичність (рис. 15). Жодна з трьох застосованих речовин не виявила явних дозозалежних ефектів. Малюнок 16: Швидкість виживання клітин IMR90 (PD 28.1) після 72-годинної інкубації з 1 мкм, 2 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм та 200 мкм 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3 ). Рівень виживання клітин IMR90, оброблених 10SH, 12SH та 14SH протягом 72 год, збільшився на 64