Фотоокислення парентеральних полівітамінів індукує стеатоз печінки у
Анотація
Фотоокиснення полівітамінних розчинів призводить до утворення пероксидів. Оскільки пероксиди пов’язані з печінковим стеатозом та фіброзом, а також холестазом, ми поставили під сумнів питання про те, чи мультивітаміни беруть участь у печінкових ускладненнях парентерального харчування. Новонароджених морських свинок розділили на групи, які внутрішньовенно отримували або загальне парентеральне харчування, фотозахищене чи ні, або контрольний розчин (5% декстрози + 0,45% NaCl), доповнений: а) полівітамінами; б) мультивітаміни фотозахищені; в) полівітаміни без рибофлавіну; або г) пероксиди (H 2 O 2, трет-бутил гідропероксид). Через 4 дні печінку відбирали на гістологію та рівень ізопростану-F 2α, маркери радикальної атаки. Полівітаміни, а також загальне парентеральне харчування були пов'язані зі стеатозом (оцінка 0-4), ступінь вираженості якого була зменшена (р 2+ та Cu + через реакції Фентона/Габера-Вейса. Крім того, можна очікувати, що антиоксидантні компоненти парентеральні полівітаміни захищають від вільних радикалів, отриманих з пероксидів, що утворюються в розчинах TPN (12).
Метою цього дослідження було оцінити роль полівітамінів у печінкових ускладненнях, пов'язаних з TPN, задокументованих гістологією, та відокремити ефект світлового впливу від впливу пероксидів та/або вільних радикалів.
МЕТОДИ
Тварина модель.
Під кетаміном/ксилазином 3-денних морських свинок (Чарльз Рівер, Монреаль, Квебек, Канада) встановлювали 0,4 мм поліуретановим катетером (Luther Medical Products, Tustin, CA, USA) у зовнішню яремну вену та екстеріоризували. в області лопатки. Катетер був з'єднаний із системою безперервного потоку, що забезпечує рухливість тварин, які розміщувались окремо в пластикових коробках із днищем із дротяної сітки. Тварин утримували в терморегульованому середовищі з 12-годинним циклом світло/темрява, і їх годували виключно внутрішньовенно зі швидкістю 240 мл/кг/добу. Через 4 дні тварин забивали, а печінку ділили на аликвоти, зразки зберігали у формаліні для гістології або подрібнювали та зберігали при -80 ° C до аналізу на тригліцериди та ізопростани, індекс радикальної атаки (17). Дослідження проводили відповідно до керівних принципів комітету тварин.
Ця модель тварини була обрана через попереднє неопубліковане нами спостереження за жировою хворобою печінки у морських свинок. Щоб перевірити, чи можна цей стеатоз запобігти за допомогою фотозахисту, слід було повторити ті самі експериментальні умови.
Протоколи
Щоб відокремити дію полівітамінів та світла, тваринам вливали один із наступних режимів, що містив розчин полівітамінів у концентрації, подібній до тієї, що використовується при парентеральному харчуванні новонароджених. Фотозахист досягався підготовкою розчинів у темряві, покриттям інфузійного набору непрозорим матеріалом та використанням фотозахищеної внутрішньовенної пробірки (13), наданою люб’язно наданою компанією Baxter Canada.
MVP + світло: 1% (об./Об.) MVP (Sabex, Boucherville, Quebec, Canada), незахищений від навколишнього світла, розведений у контрольному розчині (50 г/л декстрози + 4,5 г/л NaCl + 1 одиниця гепарину/мл); 5 мл MVP містить наступне: вітамін А, 2300 МО; вітамін D, 400 МО; α-токоферол, 7 МО; вітамін К, 200 мкг; аскорбат, 80 мг; тіамін, 1,2 мг; рибофлавін, 1,4 мг; піридоксин, 1,0 мг; пантотенат, 5 мг; фолієва кислота, 0,14 мг; ціанокобаламін, 1 мкг; нікотинамід, 17 мкг; біотин, 20 мкг; і добавки манітолу та полісорбату як емульгатори.
MVP - світло: 1% (об./Об.) Фотозахищений MVP, розведений у контрольному розчині.
TPN + світло: Два розчини, незахищені від навколишнього світла, вводили в змішаній конфігурації «зворотного відводу» поблизу місця інфузії: а) контроль + 9,6 г/кг/день амінокислот (Травасол, Бакстер Канада, Міссісога, Онтаріо), Канада) + 2% MVP при 120 мл/кг/добу; б) контролі + 9,6 г/кг/день амінокислот + 7,6 г/кг/день ліпідів (Intralipid 20%, Pharmacia, Peapack, NJ, США) при 120 мл/кг/день; для остаточної концентрації (при 240 мл/кг/день) 1% MVP + 4,8 г/кг/день амінокислот + 3,8 г/кг/день ліпідів. Склад режиму ДНЯЗ був розрахований на основі рекомендацій для досліджень на дорослих морських свинках (18).
Світло TPN (-): однаковий препарат TPN, захищений від зовнішнього світла.
Щоб оцінити, чи ефекти, що спостерігаються при MVP і TPN, були пов’язані з пероксидами та/або вільними радикалами, іншим групам тварин вливали один із наступних розчинів:
C (контроль): 50 г/л декстрози + 4,5 г/л NaCl + 1 одиниця гепарину/мл.
H 2 O 2: контроль + 200 або 500 мкМ H 2 O 2 (Aldrich Chemical, Мілуокі, Вісконсин, США) (виміряно 208 ± 15 та 500 ± 20 мкМ).
TBH: контроль + 50 мкМ TBH (Aldrich Chemical) (47 ± 1 виміряно).
Щоб виділити роль рибофлавіну та визначити, чи вплив мультивітамінів був специфічним для MVP, іншим групам тварин вводили одну з таких схем:
C: як вище
MVP + світло: як описано вище в протоколі 1.
MVP + світло без рибофлавіну: 1% MVP, приготований Sabex без рибофлавіну, незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині.
MVI + світло: 1% (об./Об.) MVI (Aventis, Страсбург, Франція), незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині; 5 мл відновленого розчину з порошку містить такі компоненти: вітамін А, 2300 ОД; вітамін D, 400 МО; α-токоферол, 7 МО; вітамін К, 200 мкг; аскорбат, 80 мг; тіамін, 1,2 мг; рибофлавін, 1,4 мг; піридоксин, 1,0 мг; пантотенат, 5 мг; фолієва кислота, 0,14 мг; ціанокобаламін, 1 мкг; нікотинамід, 17 мг; біотин, 20 мкг; і добавки BHA, BHT і маніт, а також полісорбати як емульгатори.
CVI + світло: 1% (об./Об.) Cernevit (Baxter, Канада), незахищений від навколишнього світла та розведений у контрольному розчині; 5 мл розчину містить 3500 МО вітаміну А; вітамін D, 220 ОД; α-токоферол, 11,2 МО; аскорбат, 125 мг; тіамін, 3,51 мг; рибофлавін, 4,44 мг; піридоксин, 4,53 мг; пантотенат, 17, 25 мг; фолієва кислота, 414 мкг; ціанокобаламін, 6 мкг; нікотинамід, 46 мг; біотин, 69 мкг; і добавки глікокол, глікохолева кислота та соєвий лецитин.
Гістологія.
Після фарбування гематоксилін-еозином патологію та гепатолог, не підозрюючи про внутрішньовенну терапію, провели гістологію печінки та виразили стеатоз 0–4 (рис. 1). Оцінки вказували наступне: 0 = нормальна структура печінки; 1 = наявність жирових вакуолей, видимих в ізольованих та ізольованих гепатоцитах; 2 = вогнищеві жирові зміни гетерогенного часточкового розподілу; 3 = дифузні жирові зміни з рідкісними «нежирними» ділянками; 4 = дифузні жирові зміни, без "знежирених" ділянок.
Гістологія печінки (× 250) із показниками тяжкості стеатозу від 0 до 4.
Повнорозмірне зображення
Аналітичні процедури.
Пероксиди вимірювали за допомогою помаранчевої ксилольної техніки (19), як було описано раніше. Цей хімічний аналіз, який вимірює H 2 O 2, а також органічні пероксиди (19, 20), був підтверджений для розчинів TPN за допомогою ферментативного аналізу (21). Середні рівні пероксиду для трьох зразків були MVI = 295 ± 8 мкМ; CVI = 358 ± 28 мкМ; MVP = 198 ± 14 мкМ; Фотозахищений MVP = 131 ± 10 мкМ; і MVP без рибофлавіну = 129 ± 3 мкМ. Ізопростан F 2α вимірювали за допомогою комерційного набору імуноферментних аналізів (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Рівні тригліцеридів у печінці вимірювали ферментативно за допомогою комерційних наборів (Roche Diagnostics, Лаваль, Квебек, Канада).
Статистичний аналіз.
Усі результати представлені як середнє значення ± SEM. Результати стеатозу аналізували тестом Манна-Уітні для непараметричних даних. Антропометричні характеристики тварин (таблиця 1) та печінковий ізопростан F 2α порівнювали за допомогою ANOVA після перетворення (природний логарифм), щоб забезпечити гомосцедастичність, визначену за хі-квадратом Бартлетта. Рівень значущості був встановлений на стор
Вплив парентеральних полівітамінів (MVP), NPT (5% декстрози + 0,45% NaCl + амінокислоти + ліпіди + MVP) та експозиції світла (± світло) на (A) тяжкість стеатозу печінки (позначено 0–4) та (B ) печінковий ізопростан F 2α. Полівітаміни та TPN були пов’язані зі стеатозом, ступінь вираженості якого зменшувалася завдяки фотозахисту (- легкий). Фотозахист суттєво знизив рівень ізопростану, що не відповідало тяжкості стеатозу, оскільки ДНЯЗ викликав значно вищі рівні цього ейкозаноїдного маркера атаки вільних радикалів. Кожен стовпчик представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * p 2 (рис. 2 B).
Вплив інфузійних H 2 O 2 та TBH на (A) тяжкість стеатозу та (B) ізопростан печінки F 2α. H 2 O 2 і TBH, введені в діапазоні концентрацій, що генеруються в полівітамінах, не викликали печінкових показників стеатозу вище, ніж у контролів (C = 5% декстрози + 0,45% NaCl). H 2 O 2 індукував заряд окислювача, оскільки позитивно впливав на рівень ізопростану F 2α. Кожен стовпчик представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * стор
Порівняно з контролем (C = 5% декстрози + 0,45% NaCl), фотоекспоновані (+ прозорі) полівітамінні препарати (MVP, MVI, CVI) покращували стеатоз печінки (бали від 0 до 4). Роль рибофлавіну на ефект, викликаний впливом світла, перевіряли за допомогою препарату, що не містить цього фотозбудливого вітаміну (MVP без рибофлавіну). Кожен стовпчик представляє середнє значення ± SEM (кількість зразків). * p C: