G-квадруплексний ДНК-афінний підхід до очищення ферментативно активної резольвази G4

Резюме

G4 Resolvase1 пов'язується з G-квадруплексними (G4) структурами з найбільш щільною спорідненістю до G4-зв'язуючого білка і забезпечує більшість активності розмотування G4-ДНК у клітинах HeLa. Ми описуємо новий протокол, який використовує спорідненість та АТФ-залежну активність розмотування G4-Резольвази1 для специфічного очищення каталітично активного рекомбінантного G4R1.

Анотація

Вступ

Тут ми демонструємо нову систему експресії та очищення (Фігура 1) який використовує перевагу АТФ-залежної активності розщеплення G4 rG4R1 для ефективної ізоляції активного ферменту. Ця система може бути пристосована для очищення інших АТФ-залежних ферментів нуклеїнових кислот, для яких продукт ферментативної реакції є більшою мірою субстратом для зв'язування, як це має місце для G4R1.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Підготовка G4-ДНК-структур для очищення rG4R1 (Формування біотинільованого G4-ДНК G-квадруплексу)

  1. Замовляйте наступний олігомер ДНК, який називається Z33-Bio, у масштабі 1 мкмоль: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-біотин 3'. Переконайтеся, що біотинова частина знаходиться на 3 'кінці олігомеру.
  2. Приготуйте 10-кратний буфер G4: 450 мМ Трис-HCl рН 8, 25 мМ ЕДТА і 2500 мМ NaCl.
  3. Ресуспендують олігомер Z33 у 250 мкл води (так, щоб концентрація олігомеру становила приблизно 2,5 мМ). Додайте 25 мкл 10x буфера G4 і перемішайте. Інкубуйте олігомер при 50 ° C протягом

48 год. Коротко центрифугуйте пробірку для збору конденсату (

1000 xg, 10 с). Додати

2. Підготовка структур G4-ДНК до використання в ферментативній діяльності, що аналізує rG4R1 (утворення міченої TAMRA G4-ДНК)

  1. Замовляйте наступний олігомер ДНК, який називається Z33-TAM, у масштабі 1 мкмоль: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Переконайтеся, що частина TAMRA знаходиться в кінці олігомеру 5.
  2. Дотримуйтесь тієї самої процедури, що описана у розділі 1 для утворення G-квадруплексу, за винятком того, що ультрафіолетове (УФ) тініння не потрібно, оскільки тетраметилродамін (TAMRA), мічений G-квадруплексом, буде легко видно оком неозброєним. Знову ж таки, обов’язково включіть регулятор вицвітання гелю.
  3. Після проведення спектрофотометричного зчитування міченої TAMRA міченої ДНК G-квадруплексу, як на етапі 1, розведіть утворений G-квадруплекс до 0,2 пмоль/мкл буфером TNE. Нарешті, додайте гліцерин до кінцевої концентрації 10% і зберігайте при -20 ° C.

3. Трансформуйте (DE3) компетентний pLysS за допомогою PTRiEx4-DHX36 (кодуючий плазміду людини G4R1) та вирощуйте/індукуйте великі бактеріальні культури

225 об/хв. Вирощуйте культури до тих пір, поки OD 600 не становитиме 0,4-0,6, що зазвичай займає близько 4-6 годин, залежно від початкової щільності клітин.
ПРИМІТКА: Це вимагає періодичного контролю щільності за допомогою спектрофотометричних показників, і важливо не вирощувати культури значно вище 0,5 OD. Як заготовку для спектрофотометричних показань центрифугуйте 1 мл бактерій і використовуйте освітлений бульйон як пригнічуючий розчин.

  • Як тільки буде отримано правильний OD 600, негайно помістіть культури на лід і швидко охолодіть їх до 10 ° C. Контролюйте температуру за допомогою термометра, очищеного 70% EtOH. Прискорити охолодження, швидко обертаючи флакони на льоду, що обмежує ріст бактерій перед індукцією рекомбінантних білків.
  • Додайте IPTG до кінцевої концентрації мМ 1 (

    4. Очищення rG4R1 людини

    18000 xg) у мікроцентрифузі при 4 ° C (

    200 мкл очищеного ЕВ, що містить rG4R1. Виділіть дві 7 аликвоти (у пробірках для ПЛР, позначених відповідним датою) для використання в аналізі активності ферменту контролю якості, який перевірить, чи дійсно високоактивний rG4R1 дійсно очищений.

  • Зберігайте очищений rG4R1 при -80 ° C до часу для визначення активності.

    • 5. Контроль якості аналізу очищеної ферментативної активності rG4R1

    6. Об’єднання високоактивних rg4R1, підготовки, розподілу та зберігання

    ПРИМІТКА: Для цього кроку потрібно 2 людини. Кількість та потреби ферментів у подальших аналізах, в яких буде використовуватися очищений rG4R1, визначатимуть, скільки препаратів потрібно перед аликвотуванням. Типовий препарат складається з об'єднання 8 дуже активних препаратів (таким чином із загальною кількістю 16 500 мл індукованих бактеріальних культур), але ця кількість є довільною і є лабораторною.

    7. Кількісне визначення концентрації Очищений rG4R1

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Репрезентативні результати

    Цей протокол (Фігура 1), Зазвичай отримують майже чистий каталітично активний rG4R1. Як показник активності ферменту, як правило, спостерігають, що 50% 0,2 пмоль міченої TAMRA тетрамолекулярної G4-ДНК перетворюється на мономери в межах 0,2 - 0,013 мкл rG4R1, як визначено за допомогою аналізу активності G4, описаного вище (рис. 2). Кумасі з очищеного rG4R1 вказує на одну смугу при очікуваному розмірі 120 кДа, з незначною смугою забруднення при

    75 кДа, що може представляти усічений rG4R1, який зберігав свою здатність зв'язувати G4-ДНК-кульки та елююватися в залежності від АТФ (Малюнок 3). Цікава смуга визначається кількісно на стандартній кривій білка, і цей протокол зазвичай отримує 200 мкл 20-100 нМ ферменту, очищеного на 1 л бактеріальної культури.

    g-квадруплексний
    Рисунок 1: Схема очищення в дві стадії G4R1. Позначений rG4R1 6xHis з масою очищається від лізатів кишкової палички шляхом першого зв’язування з кон’югованими кульками Co 2+ та елююванням. Далі відбувається етап зв’язування з магнітними кульками, кон’югованими з G4-ДНК. Нарешті, для отримання відносно чистого та ферментативно активного rG4R1 необхідний етап елюції, який залежить від АТФ. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Рисунок 2: Контроль ДНК G4 з Аналіз розмотування якості. Доріжки 1-6: Постійна концентрація міченої TAMRA тетрамолекулярної G4-ДНК інкубується при 37 ° C протягом 30 хв у присутності 4-х послідовних розведень очищеного rG4R1, що становить 3,9 мкл, 0,83 мкл, 0, 2 мкл, 0,05 мкл, 0,013 мкл і 0,003 мкл, відповідно. Доріжка 7: тетрамолекулярна ДНК G4 за відсутності rG4R1. Доріжка 8: Кип’ячена тетрамолекулярна ДНК-G4 для зменшення структури G4 до мономерів за відсутності rG4R1. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Малюнок 3: Кількісне визначення концентрації очищеного rG4R1. Широкий спектр білкових маркерів МВ завантажували у таких кількостях: 500, 250, 125, 62,5, 31,3 та 15,7 нг доріжки 1 - 6, відповідно, і використовували для формування стандартної кривої концентрації білка. Доріжка 7 являє собою 35 мкл rG4R1. Цей конкретний гель був визначений кількісно, ​​як частина потрійного набору гелів, в результаті чого середня концентрація білка становила 62 ± 22 нМ стандартне відхилення (N = 9) . com/files/ftp_upload/55496/55496fig3large .jpg "target =" _ blank "> Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

    Обговорення

    Цей протокол представляє високоефективну схему експресії, очищення та кількісної оцінки для виділення продукту гена DHX36, G4 Resolvase1 (G4R1, також званий Rhau та DHX36) (Фігура 1). Цей протокол використовує два етапи очищення: очищення за спорідненістю His-tag на гранулах спорідненості до кобальту та ферментативне очищення на сполучених намистинах G4-ДНК. Цей останній крок унікальний тим, що він використовує перевагу тісної спорідненості, високої специфічності та каталітичної активності, що розмотується, що rG4R1 має для структур G4. Тісна спорідненість до структур G4 (K d у діапазоні низьких рМ) дозволяє проводити високі сольові промивання (близько межі розчинності NaCl) перед елюцією гранул G4, що значно зменшує присутність неспецифічних білків. Каталітична активність G4R1 на структурах G4 дозволяє проводити специфічне елюювання активного rG4R1 при додаванні АТФ і MgCl2. Ця двоступенева схема очищення все ще виробляє дуже чистий каталітично активний rG4R1 13 у кількостях, придатних для більшості біохімічних аналізів.

    Ми виявили, що rG4R1, можливо, погіршиться, якщо необхідні умови не будуть дотримані у всьому протоколі. Для того, щоб підтримувати цілісність та активність ферменту, ми застосовуємо наступні основні запобіжні заходи. інгібітори протеази залишаються присутніми протягом усієї процедури очищення. Протокол здійснюється при 4 ° C, якщо не вказано інше. Білок очищається у присутності лактальбуміну та β-меркаптоетанолу. Протокол запускається вчасно (протягом 1 дня для очищення). Крім того, ми виявили, що багаторазові цикли заморожування та розморожування негативно впливають на активність білка, тому ми розподіляємо аликвоти білка «за одним графіком», аликвоти 7 мкл після очищення та зберігаємо їх при -80 ° C.

    Хоча присутність лактального альбуміну в препараті необхідна для підтримки цілісності та активності білка, як зазначалося вище, ми виявили, що це також може запобігти подальшому застосуванню. Інші потенційно заважаючі молекули, які присутні в очищеному препараті rG4R1, включають АТФ, β-меркаптоетанол та зв’язану ДНК пальця. Наприклад, ми виявили, що цей білковий препарат несумісний з аналізом BIACORE через високий фоновий сигнал компонентів буфера. Крім того, наявність сироватки в білковому препараті виключає використання стандартних аналізів кількісного визначення білка Брадфорде BCA. Однак ми розробили альтернативний метод кількісного визначення на основі гелю, щоб обійти це обмеження.

    Хоча в даний час цей протокол є специфічним для G4R1, його можна легко адаптувати до всього, починаючи від білків G4, що залежать від АТФ, включаючи, але не обмежуючись цим, білки BLM, WRN, FANCJ, hnRNP, hPif1 та/або ChlR1/DDX1. Змінюючи послідовність нуклеїнової кислоти, зв’язаної з гранулами стрептавідину, цей протокол можна адаптувати для очищення інших АТФ-залежних ферментів нуклеїнових кислот, для яких продукт ферментативної реакції є більше субстратом для ферменту, включаючи гелікази та нуклеази нуклеїнових кислот.

    Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.