Гостра травма мозку у мишей, що супроводжується поздовжнім двофотонним протоколом візуалізації (переклад на
Резюме
Гостра черепно-мозкова травма є серйозною травмою, яка на сьогодні не отримала належного лікування. Багатофотонна мікроскопія дозволяє поздовжньо вивчити процес розвитку гострої травми мозку та дослідити терапевтичні стратегії у гризунів. У цьому протоколі продемонстровано дві моделі гострої травми головного мозку, що вивчались за допомогою двофатонної візуалізації мозку in vivo.
Анотація
Вступ
Гостра черепно-мозкова травма є значною проблемою охорони здоров’я, оскільки частота травм виникає в автомобільних аваріях, падіннях чи пограбуваннях та велика поширеність хронічних наслідків інвалідності. Терапевтичні підходи до лікування пошкодження мозку залишаються цілком симптоматичними, тим самим обмежуючи ефективність доклінічної, хірургічної та інтенсивної терапії. Це робить соціальні та економічні наслідки пошкодження мозку особливо серйозними. З різних причин більшість клінічних випробувань не змогли продемонструвати поліпшення відновлення після пошкодження мозку із застосуванням нових терапевтичних підходів.
Моделі на тваринах мають вирішальне значення для розробки нових терапевтичних стратегій для фази, на якій прогнозується ефективність препарату у пацієнтів з травмами мозку. В даний час існує кілька встановлених моделей травм голови на тваринах, включаючи контрольований кортикальний удар, перкуторну травму рідини 2, динамічну деформацію кори 3, падіння маси 4 та фототравми. Для вивчення певних морфологічних, молекулярних та поведінкових аспектів патології, пов'язаної з травмою голови, було використано ряд експериментальних моделей. Однак жодна модель тварин не є цілком успішною у підтвердженні нових терапевтичних стратегій. Для оцінки складних патологічних процесів необхідна розробка надійних, відтворюваних та контрольованих моделей черепно-мозкових травм.
Тут ми пропонуємо вивчити метод стереотаксичного наколювання голкою шприца, який можна поєднувати з одночасним застосуванням місцевих препаратів, як вдосконалену модель місцевої травми головного мозку та як інструмент для вивчення патофізіологічних наслідків гострої травми в мозку ссавців in vivo.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Всі представлені тут процедури проводились відповідно до місцевих керівних принципів догляду за тваринами (Фінський закон про експерименти на тваринах 62/2006). Ліцензія на тварин (ESAVI/2857/04.10.03/2012) була отримана від місцевої влади (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Дорослих мишей віком від 1 до 3 місяців вагою 24-38 г утримували в індивідуальних клітках в сертифікованому університетському приміщенні для тварин і забезпечували їжею та водою за бажанням.
1. Зображення травм мозку через вікно мозку
2. Травма мозку Візуалізація через витончений череп
Створіть діаметр від 0,5 до 1,5 мм. Видаляйте уламки кісток стисненим повітрям під час свердління. Виконуйте свердління з перервами під час процедури розрідження, щоб уникнути перегрівання тертям. Охолодити свердло з розчином при кімнатній температурі і регулярно наносити буфер на розбавлену область для поглинання тепла.
ПРИМІТКА: Щоб уникнути пошкодження кори, не свердліть великі ділянки (> 1,5 мм), за винятком тонкого шару (необхідна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
1) хронічне вікно головного мозку і 2) витончення черепа для посттравматичної візуалізації мозку у трансгенних мишей: Ми оптимізували два операційні процеси. Схематичне зображення досліджуваних продуктів наведено в Рис. 1 показано. Травматичний укол через сталеву голку із зовнішнім діаметром 0,3 мм (30 Г) у свердловині (Малюнок 1А) засмучений. Успішна підготовка вікна черепа дозволяє проводити візуалізацію на глибинах до 650 мкм під поверхнею піа (Малюнок 1B), в той час як витончення черепа, як правило, має межу близько 300 мкм (1С) накласти, як при 3D-реконструкції, захищені від Thy1-YFP H кортикальні пірамідні клітини миші.
Травма уколу призводить до елімінації дендритів та руйнування капілярних мереж в контрольованому обсязі кори головного мозку. Протягом перших двох днів площа ураження збільшилася, а травма спричинила дендритні пухирі та утворення дендритних ретракційних цибулин в зонах перилезії, як показано за допомогою багатофотонної мікроскопії in vivo (Рис. 2) спостерігається.
Ми провели активацію зображення черепа Forst та міграцію мікрогліальних мишей CX3CR1-EGFP відразу після травми (Малюнок 3A). Візуалізація SHG пропонує цінний інструмент для визначення місця пошкодження (3B) розмежувати. Позаклітинні матричні молекули, що виробляють сигнали ГСГ, сильно збагачені в паренхімі мозку при травмі уколу. Перш за все викликаються дрібні мікропроцеси, потім клітини мікроглії мігрують до межі місця пошкодження (Малюнок 3A).
Для оцінки можливих пошкоджень, спричинених введенням та доставкою барвника з піпетки з тонкої скла, ми проводимо експерименти з двофотонною мікроскопією in vivo з мікроін’єкцією сульфородаміну 101 у мишей Thy1-YFP-H без травми мозку. В Рис.4 На репрезентативних зображеннях показано місце мікроін’єкції через 3 години після ін’єкції. Слід введення піпетки в мозкові оболонки за допомогою SHG (4А) розпізнати візуалізованим. Астроцити з сульфородаміном 101 шляхом ін’єкції (Рис. 4B) введений позначений. Дендрити YFP не виражають жодних морфологічних ознак пошкодження, таких як пухирі або розриви лампочок під промотором Thy1 (Малюнок 4 В) для демонстрації.
Рисунок 4. Дослідження навантаження на тканини, виконаного розчином для ін’єкцій через скляну мікропіпетку. А. Один слід (показаний штриховою лінією) при візуалізації оболонок головного мозку через 3 години після ін’єкції. B. Астроцити, мічені сульфородаміном, вводяться ін’єкцією. C. Дендрити експресують YFP під промоторами Thy1. Д. Комбіноване зображення А. (SHG - сірий), B. (Астроцити - червоний), C. (нервові дендрити - жовтий).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Травма мозку - це раптова, непередбачувана подія. Тут ми описуємо модель тварини, яка відтворює спектр крові у пацієнтів людини після пошкодження мозку, таких як нейродегенерація, видалення дендритів, набряк мозку, гліальні рубці, крововиливи в кору головного мозку, пов'язані з вогнищевим субарахноїдальним крововиливом та підвищеною проникністю патологічних змін, що спостерігаються -Мозковий бар'єр. Для дослідження первинного та вторинного патогенезу, а також відновлення після травми цю модель пошкодження поєднували з поздовжньою візуалізацією in vivo тонких нервових та гліальних структур. Використовували трансгенні лінії миші, які експресують флуоресцентні білки мікроглії (CX3CR1-EGFP) 9 у нейронах (Thy1-YFP-H) 7, астроцитах (GFAP-EGFP) 8 або. Крім того, ми використовували візуалізацію другої гармоніки (SHG) та завантаження астроцитів сульфародаміном 101 10.
Описана тут модель рекапітулює тип проникнення мозкової травми. Отже, одним з обмежень даної моделі є те, що вона не надає інформації про механізми закритої травми голови. Нещодавно Шверт та співавтори повідомили результати багатофотонних зображень щодо поведінки клітин у периконтузійній корі 6. Маючи на увазі, що закрита черепно-мозкова травма є поширеним медичним випадком, методологічний підхід, про який повідомляють автори, є дуже перспективним для традиційних методів дослідження в області ефектів мозку. Травма 11 доповнення.
Ми використовували як хронічне вікно черепа 12, так і препарати для витончення черепа 13, щоб вивчити поведінку клітин у посттравматичних умовах у живому мозку. Обидва методи мають певні переваги та обмеження. Таким чином, хронічне вікно мозку забезпечує кращу роздільну здатність, покращену оптичну глибину проникнення в мозкову тканину та зручність для декількох одиниць візуалізації. І навпаки, менше шансів викликати запалення в місці витончення зображення черепа, і, що ще важливіше, це дозволяє багаторазово застосовувати ліки та барвники. Деякі приклади фармакологічних засобів, що застосовуються в цьому типі експерименту, наведені Таблиця 1 вказано.
Таблиця 1. Фармакологічні засоби та барвники для ін’єкцій у моделі коркальної травми.
Широкий спектр біохімічних подій, які є дуже важливими у фізіологічних та патологічних умовах, можна дослідити за допомогою хімічних інгібіторів, флуоресцентних показників та мутованого білка, що вводяться за допомогою вірусних конструкцій. Переваги вибору конкретних часових вікон, які надає препарат для витончення черепа, можуть бути дуже актуальними для цих досліджень.
У цьому дослідженні ми створили сигнал другої гармоніки для розмежування місця пошкодження. Альтернативно, межі місця пошкодження можуть бути позначені слабкорозсіюючим флуоресцентним барвником, наприклад флуоресцентним кон’югатом декстрану з високою молекулярною масою (2 мільйони дальтон).
Нещодавно Шаффер та його колеги 14 використовували хронічне виробниче вікно з повторним відкриттям черепа для повторної доставки флуоресцентних барвників на кору миші. Ймовірно, що відкриття вікна черепа може негативно вплинути на прозорість мозкової тканини. Крім того, важко передбачити часовий перебіг запалення, спричиненого зворотним захопленням, яке може вплинути на відростання сполучної тканини.
Основною перевагою виготовлення витонченого черепа є здатність доставляти терапевтичні сполуки (та інші матеріали, що вимагають місцевого введення в тканини мозку) кілька разів під час прогресування травми, не ускладнюючи артефактів (наприклад, без відновлення вікна мозку).
У випадках, коли не потрібен прямий доступ до пошкодженої ділянки, ми рекомендуємо розбавити витончену ділянку черепа скляним покривним склом, як описано в роботі та сталі на полірованому препараті черепа Клейнфельдом та його колегами 15. Це можна зробити за допомогою наступні додаткові процедури. Нанесіть невелику краплю агарози (1,5%) на витончену область черепа, зачекайте, поки вона загусне, видаліть зайву агарозу, тому просто залиште її на місці травми. Агароза повинна захищати місце пошкодження від зовнішніх впливів. Висушіть стоншену верхню частину голови стисненим повітрям. Залиште невелику кількість поліакрилового клею на невеликому шматочку покривного ковпачка № 0 і покладіть його на витончену область черепа. Клей запобігає відростанню поліакрилових кісток і сполучної тканини, і таким чином зберігає витончений череп, збережений під вікном.
Поєднання цих процедур дає змогу вивчати гострі та хронічні посттравматичні процеси і доставляє ліки місцево або системно та безпосередньо контролюючи ефекти лікування. Використання подвійних або потрійних трансгенних ліній миші також може бути корисним, зокрема, для одночасного відображення численних посттравматичних процесів, таких як рубцювання гліальних клітин та відростання нервових гілок. Ми очікуємо, що наші моделі гострого пошкодження головного мозку, обстежені за допомогою інтравітальної двофотонної мікроскопії, виявляться плідними для тестування на наркотики-кандидати.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Авторам нічого розкривати.
Подяка
Ми глибоко вдячні, що доктор Френк Кірхгофф за надання штамів мишей GFAP-EGFP та CX3CR1-EGFP. Робота підтримана грантами Центру міжнародної мобільності Фінляндії, Tekes, Фінської вищої школи неврології (FGSN) та Академії Фінляндії.