Характеристика молекулярних механізмів протоколу катаракти, спричиненого УФР in vivo (переклад на
Резюме
Катаракта є основною причиною сліпоти у світі. Ультрафіолетове випромінювання сонця (УФ) є основним фактором ризику розвитку катаракти. Була розроблена тваринна модель широко індукованої УФР-В катаракти. У цій статті ми описуємо методи вивчення розвитку катаракти: вплив УФ-випромінювання, кількісна RT-PCR та імуногістохімія.
Анотація
Катаракта є основною причиною сліпоти у світі. Всесвітня організація охорони здоров’я визначає катаракту як помутніння кришталика ока, що перешкоджає пропусканню світла. Катаракта - це багатофакторне захворювання, яке включає діабет, куріння, ультрафіолетове випромінювання (УФР), алкоголь, іонізуюче випромінювання, стероїди та гіпертонію. Існують вагомі експериментальні 2-4 та епідеміологічні дані, що свідчать про те, що УФР викликає катаракту. Ми розробили модель тварин для катаракти, індукованої УФР B, як у знеболених 7, так і у знеболених тварин 8.
Єдиний засіб для лікування хірургії катаракти - це лікування доступне не всім. Було підраховано, що затримка початку катаракти на 10 років може зменшити потребу в операції з приводу катаракти на 50% 9. Для того, щоб відкласти початок катаракти, необхідно зрозуміти механізми утворення катаракти та використовувати ефективні стратегії профілактики. Серед методів розвитку катаракти апоптоз відіграє важливу роль в індукції катаракти у людей та тварин 10. Нещодавно ми зосереджуємося на апоптозі в кришталику як механізмі розвитку катаракти 8,11,12. Очікується, що краще розуміння впливу УФ-випромінювання на апоптотичний шлях забезпечить можливості для відкриття нових препаратів для запобігання катаракти.
У цій статті ми описуємо, як катаракту можна експериментально індукувати шляхом впливу UVR-B in vivo. Подальші RT-PCR та імуногістохімія представлені як інструменти для вивчення молекулярних механізмів катаракти, індукованої UVR-B.
Протокол
А. Вплив ультрафіолетового випромінювання
- За 15 хв до експозиції знеболюйте самку щура Спрег-Доулі сумішшю 90 мг/кг кеталару (кетаміну) та 10 мг/кг ромпуну (ксилазину) шляхом внутрішньочеревної ін’єкції.
- Помістіть тварину в утримувач щурів і тягніть зв’язки, поки щур не знерухомить, не стискаючи напруги 13.
- Закапувати мідріацил (тропікамід), 10 мг/мл, в обидва ока щура, щоб викликати мідріаз.
- Помістіть тварину так, щоб одне око розташувалося проти вузького променя УФР при 300 нм 10 нм 14 з повною шириною на половину максимуму, а контралатеральне око закрити чорною фольгою.
- Встановіть щуру в односторонньому порядку порогову дозу 1 кДж/м 2 UVR-B при 300 нм протягом 15 хв 15.
4. Імуногістохімічне фарбування
20 хв).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Різні джерела варіацій вимірювань оцінювали за допомогою дисперсійного аналізу, і було встановлено, що, враховуючи три вимірювання на тварину, дисперсія для вимірювань становила близько 15%, ніж для тварин. Таким чином, розглядаючи весь аналіз лінз, неможливо підвищити точність. Ортогональні тести вияснили статистично значущу різницю між повідомленнями каспази-3 між 120-годинною затримкою та меншими інтервалами затримки.
In vivo вплив УФР викликає експресію каспази-3.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
У цій роботі описуються методи, які дозволяють вивчати молекулярні події, які викликає катаракта під час UVR-B.
Враховуючи, що більша частина інформації щодо катаракти, індукованої УФР in vivo, була отримана з експериментів на щурах альбіносів Спраг-Доулі 7, 16, 17, 18, 19, ми вирішили включити щура альбіноса Спраг-Доулі в поточне дослідження для використання. Вік щурів був шість тижнів. Стать була обрана жіночою, оскільки на відміну від самців, жінки мають менше алергенної сечі. Крім того, немає гендерної різниці в тяжкості катаракти, спричиненої УФР 20.
Всіх тварин утримували та обробляли відповідно до Заяви ARVO про використання тварин у офтальмологічних та зорових дослідженнях. Етичне схвалення було отримано від Комітету з питань етики експериментів на тваринах в Уппсалі, номер протоколу C 29/10. Щурів купують у комерційного заводчика (Taconic, Данія).
Намет "> Вузькосмугове джерело УФР було обрано таким чином, щоб УФР було спектрально чітко визначеним. Максимальна чутливість кришталикової кришталика УВР-В становить близько 300 нм. Дозу 1 кДж/м 2 вибирали навколо порогової дози 15. Час експозиції 15 хвилин був обраний, щоб спричинити максимальне пошкодження лінзи 21. Доза впливу УФ-випромінювання-B та пост-експозиція можуть змінюватися залежно від експериментальної конструкції.
Парне око органу має свою перевагу у вигляді статистики та етики використання тварин у дослідженнях. Одностороннє опромінення очей може використовувати одну сторону як оголену, а іншу сторону як контроль у тварини, таким чином, це зменшує кількість тварин наполовину порівняно з непарним органом.
У цьому протоколі ми використовували анестезію як метод знерухомлення тварин. Але є також інша альтернатива, що утримувач щурів 13, який ми розробили в нашій лабораторії, може бути використаний для знерухомлення не анестезованих тварин. Перед ультрафіолетовим випромінюванням щури повинні бути кондиціоновані на утримувачі щурів. Цей пристрій також забезпечує контрольоване повторне вплив, коли анестезія не рекомендується через побічні ефекти. Тут ми маємо утримувач для щурів як місце розташування та тримач для знеболених тварин.
Утримувач для щурів виготовлений з дерева та знаходиться в різних положеннях у нашій лабораторії. Ми очищаємо свій стриманий механізм, перш ніж кожна тварина буде розміщена на ньому. Дерев’яні блоки, жолоби та дерев’яні укриття використовуються як збагачення в клітинах для щурів. Це збагачення схвалено Комітетом з етики експериментів на тваринах в Уппсалі та Федерацією європейських лабораторних асоціацій з тварин (FELASA).
Лінза повинна бути підготовлена в BSS за короткий час (5-10 хв). Це обмеження дозволяє лінзі залишатися прозорою та прозорою.
Часу 30 хв для направлення кришталика в буфер лізису RA1 достатньо для порушення капсули кришталика та кори. Ядро лінзи залишається твердим протягом 30 хвилин. Ядро кришталика або зона без органел вважається неактивною частиною кришталика як фактор транскрипції. Отже, серцевина буде вилучена із зразка, щоб збільшити відношення сигнал/шум - експресія мРНК.
ДНК-специфічний праймер, що використовується для контролю чистоти РНК (без ДНК), був обраний випадковим чином, щоб мати праймери p53. Можна вибрати будь-яку часто зустрічається закодовану послідовність ДНК, особливо геном тварин. Обидві цілі аналізували за допомогою ПЛР для 10 тварин за інтервал після експозиції, і для кожної мети вміст РНК каспази-3 визначали у трьох незалежних вимірах.
RT-PCR дозволяє виміряти цікавить мРНК. Зворотна транскриптаза перетворює мРНК у комплементарну ДНК, яка потім посилюється за допомогою ПЛР. Вимірювання кількісно визначали за допомогою стандартної кривої шляхом ампліфікації серійно розведених зразків отриманої кДНК з intERest. Переваги використання стандартної кривої полягають у тому, що стандартна крива забезпечує надійний спосіб обчислення невизначеності концентрації та що стандартна крива забезпечує кількісні вимірювання цікавої мРНК. Як варіант, відносний вміст цікавить мРНК можна оцінити шляхом прямого порівняння кількості циклів, необхідних для отримання стандартизованого флуоресцентного сигналу, використовуючи процедуру КТ. Основним недоліком калібрувальної кривої є те, що вона вимагає використання методу Ct, що перевищує кількість геномних продуктів.
Імуногістохімію застосовували для вивчення просторового розподілу активної каспази-3 в епітеліальних клітинах кришталика.
Очі негайно заморозили до -70 ° C, щоб зупинити будь-яку поточну біохімію. Потім очі зберігали при тій же температурі для збереження.
Імуногістохімія пов'язана з двома загальними проблемами: специфічністю первинного антитіла та неспецифічним зв'язуванням антитіла. Антитіло слід отримувати з добре контрольованого джерела, що гарантує специфічність. Якщо можливо, тканинний вміст епітопу слід фарбувати як позитивний контроль. Щоб випередити неспецифічне фарбування, якщо можливо, епітоп слід блокувати перед фарбуванням специфічним антитілом, негативним контролем. Крім того, неспецифічне фарбування може бути мінімізовано за рахунок оптимальної концентрації антитіла та часу реакції. Забарвлюючи як тканини, що піддаються дії УФР, так і тканини, не піддані дії УФР, можна отримати індукований епітоп УФР, тут каспаза-3. Для полегшення підрахунку клітин, що демонструють сигнал каспапс-3, зображення флуоресцентного мікроскопа записували цифровим способом. Щоб мінімізувати різницю фонових шумів, ми встановили налаштування для всіх мікроскопічних зображень.
Інтенсивність фонового сигналу флуоресценції змінюється в безперервному масштабі. Тому слід встановити поріг для значного фарбування. Однак середня флуоресценція може просторово змінюватися в межах спостережуваного зрізу, ускладнюючи використання абсолютного порогу значного забруднення. Тому, як правило, судження про конкретне фарбування базується на досвідченому спостерігачеві, а абсолютне конкретне фарбування залежить від думки досвідченого спостерігача, але буде послідовним для цього спостерігача. З цієї причини використовувався лише досвідчений спостерігач. Для поліпшення того, що спричинено експериментальним змінним впливом УФ-випромінювання порівняно з шумом, фотографії кожної секції підраховували тричі.
По можливості імуногістохімію слід підтверджувати вестерн-блот, щоб перевірити існування епітопів із очікуваним молекулярним розміром.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.