Харчові компоненти та їх вплив на патогенез аутоімунного діабету у людей та
1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Кафедра харчової фізіології Харчові компоненти та їх вплив на патогенез аутоімунного діабету у людей та мишей Даніела Беттіна Мюллер Повна копія докторської дисертації, затвердженої Науковим центром харчування, землекористування та навколишнього середовища Мюнхенського технічного університету в Вейхенштефані. Доктор побутових та харчових наук Голова: Експерт дисертації: ун-т проф. Лікар. Дж. Дж. Хаунер 1. Університет-проф. Лікар. Х. Даніель 2-й апл. A-G. Циглер Дисертація була подана до Мюнхенського технічного університету та прийнята Науковим центром харчування, землекористування та навколишнього середовища Вайгенштефана на.
2 Для моїх двох дідусів
3 Зміст Зміст 1 Завдання Вступ та огляд літератури Основи діабету 1 типу Важливість генетики Патогенез та імунологічний фон діабету 1 типу Пшениця та її білкові фракції Целіакія та зв'язок між діабетом 1 типу та целіакією Вплив білків пшениці на розвиток аутоімунного діабету на тваринних моделях Діабет типу 1 Вплив дієтичних факторів на розвиток аутоімунного діабету на тваринній моделі коров’ячого молока та його білкових фракцій Вплив білків коров’ячого молока на розвиток аутоімунного діабету на тваринній моделі Вплив пшениці та коров’ячого молока на цукровий діабет 1 типу Асоціація асоційованої з кишечником імунної системи та аутоімунного діабету Інші компоненти їжі та їх можливий потенціал Асоціація з діабетом 1 типу Матеріал та методи Дослідження на моделі миші NOD Група мишей Дієта Протокол Частковий експеримент 1 та 1а Протокол Частковий експеримент Протокол Частковий експеримент Я
4 Зміст 3.2 Експериментальні методи Екстракція зерна для отримання білкових фракцій Виробництво білкових екстрактів з їжі або кормів Електрофоретичне розділення білкових фракцій (SDS-сторінка) Визначення вмісту білка в екстрактах вимірювання аутоантитіл IgG інсуліну в мишачих та людських сироватках Аналіз зв’язування радіолігандів з харчовими компонентами IAA спорідненість з курячим інсуліном IgA інсуліну аутоантитіл до інсуліну в сироватках людини Статистика Результати Експерименти з годуванням з мишами NOD Споживання їжі та розвиток ваги мишей NOD в експериментальних групах Частковий експеримент 1 Пшениця та казеїнвмісні корми порівняно з базальною дієтою Кумулятивний ризик діабету мишей NOD у частковому експерименті з поширеністю аутоантитіл до інсуліну Миші NOD у віці десяти тижнів життя в частковому експерименті Захворюваність на діабет у мишей NOD до і після 25 тижнів життя в частковому експерименті частковий експеримент 2 Компоненти пшениці та пшениці Кількісне визначення ерація та якість вилучених фракцій пшениці Кумулятивний ризик діабету мишей NOD у частковому тесті Переважання аутоантитіл до інсуліну мишей NOD у віці десяти тижнів у частковому тесті II
6 Зміст 5.1 Експерименти з годуванням з мишами NOD Вплив різних джерел білка на розвиток діабету в моделі NOD Вплив розподілених добавок пшениці та окремих фракцій білка пшениці на розвиток діабету в моделі NOD Вплив інших харчових компонентів у харчуванні маленьких дітей на розвиток діабету в моделі NOD Завершуючи розгляд харчових експериментів на NOD -Модель реактивність аутоантитіл до інсуліну людини з курячої інсуліну і вимір изотипа IgA-Binding поведінку інсуліну аутоантитіл до курячим інсуліну в сироватці крові людини ідентифікації IgA інсуліну аутоантитіл ізотипів в сироватці крові людини заключного розгляду тестів на зв'язування властивостей і ізотипів зв'язують властивостей інсуліну аутоантитіл до зв'язування інсуліну аутоантитіл до аутоантитіл до інсуліну, що зв'язуються з аутоантитіл до інсуліну в аутоантитіл до інсуліну, що зв'язуються з інсуліну аутоантитіл зв'язування krossein Дослідження зв’язування аутоантитіл до інсуліну з окремими білками з харчовими компонентами в сироватках людини Фракції коров’ячого молока Заключний розгляд тестів на перехресно реагуючі аутоантитіла до інсуліну Майбутні перспективи Резюме та висновки Література IV
7 Зміст Зміст. Список малюнків. Список таблиць. Список скорочень. I-V VI-VIII IX-X XI Попередні публікації. XII автобіографія. XIII-XIV подяки. XV V
10 Список малюнків Рис. 26 Зв'язування IAA з молоком, молочними білками, сумішами та пшеницею порівняно з людським інсуліном Рис. 27 Криві зв'язування IAA з харчовими компонентами 75 Рис. 28 Криві зв'язування IAA з білками молока Рис. 29 Зв'язування IAA з різними білками молока порівняно з Інсулін (частина 1) Рис. 30 Зв'язування IAA з різними білками молока порівняно з інсуліном (частина 2) Рис. 31 Зв'язування IAA з різними білками молока порівняно з інсуліном (частина 3) VIII
12 Перелік таблиць Таблиця 20 Аналіз концентрації білка в екстрагованих харчових розчинах у різних розведеннях та отримані середні значення Таблиця 21 Характеристика досліджуваних, IAA яких зв’язується з екстрактом сухого молока X
13 Список абревіатур Список абревіатур Рисунок Рисунок АК Антитіло аспарагін cpm радіоактивний розпад в хвилину (відліки в хвилину) GAD (A) (антитіла проти) глутаматдекарбоксилази HLA комплекс гістосумісності (людський лейкоцитарний антиген) I (A) A Інсулін (ауто) антитіло IA-2 ( A) (антитіла проти) білка тирозин фосфатази IA-2 ICA острівцеві клітини антитіла Ig імуноглобулін MHC основний комплекс гістосумісності хв. Хвилин nb невідомий NOD аналіз зв’язку без діабетів RBA з радіолігандами обертів об/хв об/хв. Таблиця діабету T1D типу 1. Таблиця TBST Буферований сольовий розчин Tris та Tween TBT Буферований Tris tween t-tg-транглутаміназа проти Транспортера цинку ZnT8 ВООЗ 8 XI
16 завдань, які можна розглядати як потенційні вихідні цільові антигени IAA. Загалом, ця робота повинна розробити можливий вплив окремих компонентів їжі на імунний процес аутоімунного діабету. Використовуючи дані, отримані in vivo на моделі NOD, потенційно діабетогенні харчові компоненти тестують на сироватках людини. За допомогою цих моделей in vitro буде досліджено, наскільки імунні події діабету 1 типу спочатку можуть бути спричинені перехресними реакціями з харчовими компонентами. Результати цих експериментів могли б описати подальші, раніше невідомі механізми патогенезу діабету, і, отже, використовуватись для розробки первинних методів лікування для запобігання розвитку діабету 1 типу в ранньому дитинстві. 3
41 Матеріал та методи (дієта D), друга група залишалася на пшеничновмісному раціоні A, а третя група залишалася на безпшеничному раціоні B. Жіночі цуценята в племінній групі клейковини та безказеїнової дієти C були віднесені до дослідної групи 9 самок тварин, які залишились на дієті С (див. Рис. 4). Розмноження пар Безглютенова дієта, що містить казеїн B Дієта без глютену та казеїну C Тестові групи Дієта B n = 12 Дієта A n = 12 Дієта D n = 12 Дієта C n = 9 Рис. 1. Самці молодих тварин племінної групи безглютенової дієти В були відокремлені від дамб після лактації у віці трьох тижнів, як описано для жіночих тварин, і розділені на три тестові групи. Аналогічно групуванню самок мишей, одна з груп отримувала еталонну дієту (дієта D), друга - пшеничну дієту А, а третя група залишалася на безжитній дієті В (див. Рис. 4а). Розмноження пар безглютенової, що містить казеїн дієти B Тестові групи Дієта B n = 11 Дієта A n = 10 Дієта D n = 12 Рис. 4a Розподіл самців мишей NOD до племінних та дослідних груп у суб-експерименті 1a. 28
46 Матеріал і методи Для того, щоб відокремити білкові фракції, що містяться в пшениці, одна від одної проводили модифіковану триступеневу екстракцію, завдяки якій на першій стадії екстракції альбуміни та глобуліни були в супернатанті, на другій стадії екстракції проламіни (гліадини) містилися в надосадовій рідині та з На останньому етапі глютеніни були розділені (Wilson and Goulding 1991, Mimouni et al. 1998, Nicolas et al Idris et al. 2003). Екстракція борошняних альбумінів та глобулінів Центрифугування> 2x осаду Екстракція гліадину Центрифугування> 3x Екстракція глютелінового осаду (атмосфера N 2) Центрифугування> 2x центрифугування всіх супернатантів Зберігання опадів при 18 C Рис. 7 Схема вилучення білка та виділення фракцій із пшеничного борошна. 0,1 г комерційно доступного пшеничного борошна типу 550 зважували, додавали 1 мл буфера Серенсена (рН 7,35) і суміш струшували при 4 ° С протягом 20 хвилин. Після центрифугування (20 хв, 1000 об/хв, суперскоростна центрифуга Sorvall RC 5B) при 4 ° С, супернатант видаляли і осад ще раз екстрагували тим же методом після додавання буфера Соренсена. Два супернатанти об'єднували і зберігали при 4 ° С до завершення подальших етапів екстракції. 33
60 результатів Отримання кількості альбумінів та глобулінів, які вводили мишам NOD з питною водою. Для перевірки методу екстракції основні білки пшеничного борошна фракціонували, а чистоту поділу перевіряли за допомогою гель-електрофорезу (матеріал та методи 3.2.3). Стандартні альбуміни та глобуліни Глютеніни Гліадини Рис. 10 Електрофоретичне розділення фракцій білка пшениці на 12% поліакриламідному гелі. Окремі білкові фракції присвоюються відповідним смугам, а молекулярні ваги відображаються у kda на лівій стороні. Крім того, ефективність екстракції визначали кількісним визначенням білка за допомогою набору для аналізу білка BCA (див. Табл. 16 та Матеріали та методи 3.2.4) і приблизно 50% виходу бажаної фракції альбуміну та глобуліну використовували як основу для екстракцій розміщений. 47