Хімічна ампутація та регенерація глотки у планарському Schmidtea mediterranea

Резюме

Planarian Schmidtea Mediterranea - відмінна модель для вивчення стовбурових клітин та регенерації тканин. У цій публікації описується метод вибіркового видалення органу, горла, шляхом впливу на організм хімічних речовин азиду натрію. Цей протокол також описує методи моніторингу регенерації горла.

Анотація

Планарії - це плоскі черви, які надзвичайно ефективно відновлюються. Цією здатністю вони зобов’язані великій кількості стовбурових клітин, які можуть швидко реагувати на будь-який тип пошкодження. Поширені моделі травм у цих тварин видаляють велику кількість тканини, яка пошкоджує кілька органів. Для того, щоб подолати це широке пошкодження тканин, ми описуємо тут спосіб спеціального видалення одного органу, горла, у планарської Schmidtea Mediterranea. Ми досягаємо цього замочуванням тварин у розчині, що містить інгібітор цитохромоксидази азид натрію. Короткий вплив азиду натрію викликає екструзію горла тварини, що ми називаємо "хімічною ампутацією". Хімічна ампутація видаляє весь зів і створює невелику ранку там, де глотка лежить у кишечнику. Після тривалого промивання всі ампутовані тварини відновили повністю функціональне горло приблизно за тиждень. Стовбурові клітини в іншій частині тіла сприяють регенерації нового горла. Тут ми надаємо докладний протокол для опису хімічної ампутації та гістологічних та поведінкових методів для оцінки успішної ампутації та регенерації.

Вступ

Регенерація - явище, яке відбувається у всьому царстві тварин, при цьому здатність до регенерації варіюється від регенерації всього тіла у певних безхребетних до більш обмежених можливостей у хребетних 1. Заміна функціональних тканин є складним процесом, і часто одночасне відновлення декількох типів клітин тягне за собою. Наприклад, кінцівки саламандри, остеобласти, хондроцити, нервові клітини, м'язи та клітини епітелію потребують регенерації 2 заміщених. Крім того, ці новостворені типи клітин повинні бути правильно організовані, щоб полегшити нову функцію кінцівки. Розуміння цих складних процесів вимагає методів, що фокусуються на регенерації певних типів клітин та їх інтеграції в органи.

Однією із стратегій спрощення дослідження регенеративних реакцій є цілеспрямована абляція певних типів клітин або більших колекцій тканин. Наприклад, експресія нітроредуктази в певних типах клітин у даніо призводить до їх знищення після використання метронідазолу 3, 4. У личинок дрозофіли, що аблягуються, експресуючи проапоптотичні гени під тканиноспецифічними промоторами, націленими на певні ділянки імагінального диска 5, 6. Обидві ці стратегії завдають швидких, але контрольованих пошкоджень і використовувались для розтину молекулярних та клітинних механізмів, відповідальних за регенерацію.

У цьому рукописі ми описуємо метод вибіркової абляції цілого органу, який називається глоткою, у середземноморському планарському шмідтеї. Планарії - це класична модель регенерації, відома своєю родючою здатністю до регенерації, коли навіть найменші фрагменти цілих тварин 7, 8 відростають. Вони мають велику неоднорідну популяцію стовбурових клітин, що складаються з плюрипотентних клітин і родоначальників з обмеженим походженням 9, 10, 11. Ці клітини розмножуються та диференціюються, щоб замінити будь-які відсутні тканини, включаючи горло, нервову, травну та видільну системи, а також м’язові та епітеліальні клітини 9, 10, 12. Ми знаємо, що ці стовбурові клітини ініціюють регенерацію, ми не до кінця розуміємо молекулярні механізми, що змушують їх замінювати ці різні типи клітин. Визначені травмовані методи, які можуть викликати точні реакції стовбурових клітин, допомагають розмежувати цей складний процес.

Зів - це велика циліндрична трубка, необхідна для харчування, і містить нейрони, м’язи, епітеліальні та секреторні клітини 13, 29. Зазвичай прихований у кишені на животі тварини, він простягається над окремим тілом тварини, щоб відкрити відчуття присутності їжі. Для вибіркової ампутації глотки ми замочуємо планарії в хімічній речовині, що називається азидом натрію, загальновживаним анестетиком у C. elegans 14, 15, 16. Вперше про його використання в планаріях повідомили Adler et al., 2014-12. Протягом декількох хвилин впливу азиду натрію планарії екструдують свої глотки і з м’яким збудженням горла відокремлюють тварину. Цю повну та вибіркову втрату горла ми називаємо «хімічною ампутацією». Через тиждень після ампутації повністю функціональне горло відновлюється 12-го числа Оскільки глотка необхідна для годування, функціональну регенерацію можна виміряти, контролюючи поведінку годування. Далі ми описуємо протокол хімічної ампутації та оцінки регенерації горла та відновлення поведінки годування.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

3. Оцінка видалення глотки після ампутації

Огляньте тварин під мікроскопом (зі збільшенням 10-20X), щоб побачити, чи з’явилася темна пляма після зняття виділення з горла, як на малюнку 2Апоказано.
Як варіант, виправити та відбілити тварин згідно з протоколом Пірсона та ін. описано 20. Замочіть тварин на ніч у 4 ', 6-діамідино-2-феніліндолі (DAPI) або кон'югованому з культурами тканини стрептавідині (1 мг/мл, розведений 1: 500, 1X сольовий розчин, забуференний фосфатом, з 0,3% Тритоном-X). Тварини на предметних стеклах у 80% гліцерині/20% 1Х фосфатному сольовому розчині та зображення під флуоресцентним стереомікроскопом (рис. 2 b) кріплення.
Примітка: Всі зображення в цьому рукописі були зроблені на флуоресцентному стереомікроскопі з ціллю 1,0X.

4. Оцінка регенерації глотки шляхом вимірювання поведінки годування

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Вплив азиду натрію порушує нормальну рухливість планарій, змушуючи тварин розтягуватися і звиватися. Ці рухи змушують горло виходити з черевної сторони тварини, і приблизно через 6 хвилин у розчині азиду натрію видно білий кінчик горла (Малюнок 1 b-ліворуч). Через кілька хвилин тварини активно скорочуються і повністю розширюють горло, витісняючи його з тіла. (Малюнок 1 b-Центр). Розслабтесь приблизно через 11 хвилин після впливу азиду, тварин та горла. На цьому етапі добре видно типову дзвонову форму горла (Малюнок 1 b-права панель). Для простої ампутації важливо дочекатися розслаблення глотки.

Оскільки глотка - це велика, непігментована маса тканини, вона усуває появу темної плями на спинній стороні ампутованого тварини (Малюнок 2А). Ця темна область є візуальним показником успішної ампутації живих тварин. Пляма видно відразу після ампутації і стає помітнішим на наступний день. У міру відновлення глотки ця область зменшується. Для більш пильного моніторингу регенерації глотки тварин також можна забарвити DAPI або культури тканин, кон'юговані зі стрептавідином, протягом ночі (Рис. 2 b). Для кількісної оцінки ступеня регенерації горла його площа може бути виміряна за допомогою програмного забезпечення ImageJ.

ілюстрація 1 . Відхаркування та ампутація глотки. (A) Схематичне зображення анатомії планарії. (B) На живих знімках тварин виявляється мокрота глотки після замочування в 100 мМ азиду натрію. Червоні стрілки позначають горло. Масштабні смуги = 750 мкм. (C) Зображення живих тварин (зліва) та принципова схема (праворуч) ампутації пінцетом. На панелях показано два різні варіанти захоплення горла. Живіт тварини звернений вгору. Масштабні смуги = 500 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 2 . Оцінка ампутації та регенерації горла. (A) репрезентативні фотографії живих тварин у певний час до та після ампутації. Середня область показує темну пляму в області глотки після ампутації, виділену пунктирним білим полем. Спинна сторона звернена вгору. Масштабні смуги = 500 мкм. (B) репрезентативні зображення тварин, забарвлених Alexa488-стрептавідином у певний час до та після ампутації. Середня панель показує відсутність горла після ампутації. Глоткова область виділена білою рамкою. Обличчям вгору. Шкала шкали = 500 мкм. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.

Малюнок 3. Оцінка регенерації горла. (A) Зображення та схеми аналізу годування, проведеного шляхом поміщення 25 мкл печінки в центр 60-міліметрової чашки Петрі. Принципова схема (зверху, ліворуч) та малюнок (посередині) показують поведінку годування у тварин з неушкодженими глотками. Вгорі праворуч - зображення тварини, яка поїла. Принципова схема (внизу ліворуч) та зображення (в центрі) поведінки годування тварин через 1 день після ампутації. Унизу праворуч, тварина, яка не їла. Шкала шкали = 750 мкм. (B) Результати аналізу годування. Частка тварин, які споживали їжу (кількісно визначається червоним забарвленням) у певний час після ампутації. Для кожного моменту часу n = 10 тварин, повторених у трьох примірниках. Панель помилок = SD Будь ласка, натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Цей протокол описує метод вибіркової абляції горла азидом натрію. Подальші цілеспрямовані дослідження абляції у планарії використовували модифіковану хірургічну операцію для видалення фоторецепторів 21 або фармакологічне лікування для абляції дофамінергічних нейронів 22. Великою перевагою хімічної ампутації перед існуючими методами є те, що вона не вимагає хірургічного втручання. Жорстка будова горла порівняно з рештою тіла Планарського полегшує його повне видалення від тварини, яка набагато м'якше. Глотка також відокремлює тварину в малому з’єднанні (стравохід) 30, приєднуючись до глотки та кишечника, утворюючи більше відтворювану рану, ніж індукована більшим хірургічним інструментом. Завдяки своїм фізичним властивостям і невеликому анатомічному зв'язку з рештою тварини, видалення глотки, таким чином, створює більш однорідні рани, ніж інші хірургічні ампутації.

Тривалість впливу азиду натрію також є критично важливою для успіху цієї методики. Хоча короткочасний вплив азиду натрію не впливає негативно на планарії, тривалі періоди часу є отруйними і врешті-решт вбивають тварин. Відомо, що азид натрію інгібує енергозалежні процеси шляхом інгібування цитохромоксидази 23,24. Крім того, він пригнічує транскрипцію та трансляцію, ймовірно, через накопичення ключових компонентів цих реакцій у гранулах стресу 25. У планаріанів вплив азиду натрію пригнічує мітоз протягом 24 годин, після чого клітини продовжують проліферацію 12. Такі зміни, як Б. Обмеження тривалості впливу азидів, усунення азиду натрію при ретельному промиванні та врівноваження захисту від перенапруг у мітотичному стані в експериментальній конструкції може допомогти подолати ці межі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори нічого не розкрили.

Подяка

Ми хотіли б подякувати Алехандро Санчесу Альварадо, який допоміг у початковій оптимізації та розвитку цієї техніки. Лабораторія Каролін Адлер підтримується за рахунок грошей від Корнельського університету.