Хімічна візуалізація ліків від стеатозу печінки
Франсуа Ле Наур 1 *, Кетрін etеттьє 2, Ален Брунель 3, Олів'є Лапревоте 3, 4 та Поль Дюма 5
1 Inserm U602, University Paris-Sud 11, Institut André Lwoff, 14, avenue Paul Vaillant Couturier, 94807 Villejuif Cedex, Франція
2 Inserm U785, Université Paris-Sud 11, Institut André Lwoff, відділення патологічної анатомії, лікарня Поля Броуса, 14, проспект Поля Вайлана Кутюр'є, 94807 Villejuif Cedex, Франція
3 Дослідницький центр GIF, Інститут хімії природних речовин (ICSN), CNRS, avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, Франція
4 Токсикологічна лабораторія, IFR 71, Факультет фармацевтичних та біологічних наук, Університет Парижа-Декарта, 4, avenue de l'Observatoire, 75006 Париж, Франція
5 SOLEIL Synchrotron, L’Orme des Merisiers, 91192 Gif-sur-Yvette, Франція
Печінковий стеатоз
Печінковий стеатоз - часта патологія, яка може бути наслідком вживання алкоголю або дисметаболічного синдрому, пов’язаного з ожирінням, діабетом, гіпертригліцеридемією. Ймовірно, він переросте у стеатогепатит, стеатофіброз та цироз із ризиком вторинного розвитку гепатоцелюлярної карциноми [1]. У західних суспільствах стеатоз, пов'язаний з дисметаболічним синдромом, став основною проблемою охорони здоров'я.
Основною характеристикою стеатозу є накопичення триацилгліцерину (TAG) та діацилгліцерину (DAG), що призводить до утворення вакуолей або пухирців у гепатоцитах. Це накопичення є результатом дерегуляції ліпідного обміну (поглинання, синтез, експорт та окислення жирних кислот) [2, 3]. Однак ранні явища, що призводять до збільшення ліпідів, невідомі, а склад ліпідів мало вивчений. Вивчення цих змін може покращити наше розуміння механізмів, що лежать в основі формування стеатозу, і призвести до визначення нових діагностичних або прогностичних маркерів. З цією метою ми провели аналізи на основі інфрачервоної мікроспектроскопії з високою просторовою роздільною здатністю (за допомогою синхротронного випромінювання) та мас-спектрометрії ToF-SIMS (час польоту вторинної іонної мас-спектрометрії) з метою проведення хімічної візуалізації та дослідження складу стеатозу [4].
Синхротронна інфрачервона спектроскопія
Інфрачервона спектроскопія заснована на поглинанні інфрачервоного світла вібраційним резонансом хімічних функцій молекул. Біологічна тканина складається в основному з білків, ліпідів, нуклеїнових кислот та цукрів. Кожен із цих класів молекул має специфічні характеристики поглинання в інфрачервоному діапазоні. Таким чином, інфрачервона спектроскопія дозволяє зрозуміти загальний склад тканини. Можливість використання синхротрону як джерела світла розсунула межі інфрачервоної спектроскопії до її фізичних меж, таких як дифракція. Дійсно, винятковий блиск синхротронного світла дозволяє отримати просторову роздільну здатність у кілька мікрон, а записані спектри мають дуже високу якість, що дозволяє проводити аналіз місцевого біохімічного складу нормальних або патологічних тканин на клітинному рівні та субклітинному [ 5, 6].
Ліпідомія на місці методом мас-спектрометрії ToF-SIMS
Мас-спектрометрія ToF-SIMS передбачає бомбардування зразка сфокусованим пучком первинних іонів, найчастіше з агрегатів важких металів. Первинні іони відкладають свою енергію на поверхню зразка і виробляють вторинну іонізацію його складових. Потім утворені таким чином вторинні іони аналізують за допомогою мас-спектрометра. На зрізі тканини ця методика дозволяє проводити аналіз без апріорі дуже багато видів з молекулярною масою менше 1500 Да. Тому він підходить для дослідження ліпідів. Таким чином, мас-спектрометрія ToF-SIMS дає змогу зрозуміти склад та місцевий розподіл ліпідів у мікронній шкалі [7–9].
Хімічне зображення жирової печінки за допомогою інфрачервоної спектроскопії та ToF-SIMS
Склад і розподіл біохімічних складових у стеатотичній печінці були зрозумілі на місці на зрізах тканин за допомогою інфрачервоної синхротронної спектроскопії, а також мас-спектрометрії ToF-SIMS. Основною перевагою цих двох типів спектроскопії є те, що вони не вимагають хімічної обробки, фарбування або маркування для їх здійснення. Ці методи можна проводити на заморожених зрізах тканин, що готуються звичайно в лікарні з біопсійних зразків (товщиною від 5 до 10 мкм). Крім того, просторова роздільна здатність цих двох методів має однаковий порядок величини (від 1 до 10 мкм). Експерименти з інфрачервоною спектроскопією проводились на синхротроні SOLEIL, розташованому на півдні Парижа (плато Сакла) 1, і деякі лінії променя відкриті для зовнішніх користувачів протягом декількох місяців. Роздільна здатність інфрачервоного променя від SOLEIL дозволила отримати кілька спектрів в межах однієї і тієї ж стеатотичної вакуолі.
Хімічна візуалізація стеатозу за допомогою інфрачервоної спектроскопії. Стеатотична печінка характеризується утворенням вакуолей, багатих ліпідами (оптичне зображення). Спектри інфрачервоного поглинання були отримані в результаті отримання на стеатотичних вакуолях (червоний графік) або нестеатотичних областях (зелений графік). Розподіл за зрізом певних складових, що відповідають певним смугам, можна візуалізувати, посилаючись на кольорову гаму.
Ліпідомічний аналіз на місці стеатозу методом мас-спектрометрії ToF-SIMS. За допомогою мас-спектрометрії ToF-SIMS можна виявити іони, які відповідають складовим, що знаходяться на поверхні аналізованого зразка. Розподіл кожного компонента можна переглянути на зображенні поперечного перерізу. На зрізах стеатотичної печінки можна спостерігати концентрацію холестерину в стеатотичних вакуолях. Суперпозиція розподілу DAG C30 і C36, а також насичених і ненасичених ліпідів демонструє селективну концентрацію в стеатотичних вакуолях видів з довшими вуглецевими ланцюгами, що несуть ненасиченість.
Ці спостереження піднімають питання про механізми утворення вакуолей ліпідів під час стеатозу. Дійсно, селективна концентрація холестерину та DAG, що несуть довші ненасичені вуглецеві ланцюги, також може бути результатом пасивного процесу збільшення цих ліпідів на основі їх фізико-хімічних властивостей, а також активного явища, що включає енергетичний та ферментний обмін. Крім того, концентрація ненасичених ліпідів у стеатотичних вакуолях є показником потенційної небезпеки жирової хвороби печінки, яка довгий час вважалася доброякісним станом. Ненасичені ліпіди можуть бути предметом реакцій перекисного окислення. Це радикальні реакції, які поширюються за допомогою ітераційного процесу, який надає стеатотичній вакуолі високореакційний потенціал. Ці реакції спричиняють молекулярні та клітинні пошкодження, що може призвести до більш серйозних патологічних станів стеатогепатиту, стеатофіброзу та цирозу [10–12].
Спектроскопічні підходи дозволяють виявити ранні зміни біохімічного складу
Порівняльні дослідження були проведені з використанням нестеатотичних ділянок патологічної та здорової печінки. Морфологічно ці тканини подібні. Однак інфрачервона спектроскопія виявила багато варіацій інтенсивності, включаючи смуги, що відповідають ліпідам та цукру. Мас-спектрометрія ToF-SIMS показала наявність невеликих крапель ліпідів, ймовірно, що відповідають першим подіям нарощення ліпідів. Ці спостереження вказують на те, що спектроскопічні підходи можуть виявити ранні зміни в біохімічному складі тканини.
Outlook
Ця робота висвітлює значення спектроскопічних підходів для виявлення ранніх змін біохімічного складу під час патологічних процесів. Просторова роздільна здатність та чутливість інфрачервоної спектроскопії та спектроскопії ToF-SIMS припускають можливість характеристики на місці ці ранні події для виявлення нових діагностичних або прогностичних маркерів. Застосування цієї ранньої роботи може бути численним, оскільки можна впровадити інфрачервону спектроскопію в лікарняних умовах за допомогою комерційних інструментів із використанням звичайних джерел для клінічного використання на основі знань, отриманих під час експериментів у цій галузі.
Конфлікт інтересів
Автори заявляють, що не мають конфлікту інтересів щодо даних, опублікованих у цій статті.