Ідентифікація метаболічно активних бактерій в кишечнику Spodoptera littoralis

Резюме

Активну бактеріальну спільноту, пов’язану з кишкою Spodoptera littoralis, визначали шляхом стабільного зондування ізотопів (SIP), поєднаного з піросеквенуванням. За допомогою цього методу ідентифікація метаболічно активних видів бактерій у межах спільноти проводилася з високою роздільною здатністю та точністю.

Анотація

Кишки більшості комах патогенно не заселяються складними спільнотами симбіотичних бактерій. У межах цих мікробних спільнот можна потрапити або визначити мутуалістичні види бактерій. Спостерігалося, що останні виконують кілька функцій для комах, тим самим допомагаючи у розмноженні комах, сприяючи імунній реакції 2, виробленню феромонів 3, а також харчуванню, включаючи синтез незамінних амінокислот 4, серед іншого.

Через важливість цих асоціацій було докладено багато зусиль для характеристики спільнот аж до окремих членів. Більшість цих зусиль були засновані або на методах культивування, або на генерації фрагментів гена 16S рРНК, які були секвенувані для остаточної ідентифікації. На жаль, ці підходи визнані лише такими, що існують у кишкових бактеріальних видах і не дають інформації про метаболічну активність мікроорганізмів.

Для характеристики метаболічно активних видів бактерій у кишечнику комахи ми використовували стабільне ізотопне зондування (SIP) in vivo, застосовуючи 13 C-глюкозу як універсальний субстрат. Це перспективна техніка без культури, яка дозволяє мікробним родоводам пов’язувати їх певну метаболічну активність. Це можливо шляхом відстеження стабільних мічених атомами ізотопів із субстратів у мікробних біомаркерах, таких як ДНК та РНК 5. Включення ізотопів 13 С у ДНК збільшує щільність міченої ДНК порівняно з неміченою (12 С). В кінці, 13-мічена ДНК або РНК відокремлюється від 12-С-немічених подібних 6 за допомогою ультрацентрифугування з градієнтом щільності. Подальший молекулярний аналіз відокремлених ізотопологів нуклеїнової кислоти встановлює зв'язок між метаболічною активністю та ідентичністю виду.

Тут ми представляємо протокол, який використовується для характеристики метаболічно активних бактерій у кишечнику комахи-генераліста (наша модельна система), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Філогенетичний аналіз ДНК проводили за допомогою піросеквенування, що дозволяє отримати високу роздільну здатність та точність ідентифікації кишкових бактеріальних спільнот комах. В якості основного субстрату в експериментах використовували 13-мічену глюкозою. Субстратом годували комах штучним харчуванням.

Вступ

З появою технологій секвенування на основі ПЛР кількість досліджень із використанням біоти кишечника з різних організмів (тобто людей, комах або морських організмів) збільшується. Крім того, результати виділення та вирощування кишкових бактерій, що містять кишечник, незалежні, ніж у минулому. Майже 99% бактерій неможливо культивувати, і важко імітувати умови середовища, що переважають у кишечнику 12. За допомогою ПЛР фрагменти гена 16S рРНК (широко поширений філогенетичний маркерний ген серед бактерій) можуть бути вибірково вилучені із змішаного шаблону ДНК кишкових бактеріальних спільнот, секвенувати, ампліфікувати, клонувати. За допомогою цієї інформації користувач може ідентифікувати види бактерій після збору інформації про послідовність із загальнодоступних баз даних 13, 14. Тим не менше, підходи до секвенування для опису бактеріальних спільнот неадекватні через відсутність інформації про метаболічний внесок кожного виду в межах спільноти.

Тут ми використовуємо 13 С-глюкозу, щоб `` позначити '' ДНК метаболічно активних видів бактерій у кишечнику. Глюкоза - це цукор, що використовується більшістю видів бактерій на широко розповсюдженому шляху Ентнера-Дудорова (ЕД), хоча відомі винятки 20. Це виправдовує використання 13 С-глюкози як надійного зонда, що з'єднує метаболіти, що нас цікавлять, і метаболізм Джерело вуглецю вздовж встановлених шляхів. Залежно від наукового питання, інші субстрати, тобто 13 C-метан, 13 CO 2 або рослини в атмосфері 13 CO 2, можуть використовуватися для вирішення метаболічної діяльності.

На цьому етапі ми представляємо протокол, який використовується для метаболічної характеристики бактеріальної спільноти в кишечнику комахи-спеціаліста, а саме S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Крім того, метод був поєднаний з піросеквенуванням, що, у свою чергу, дозволяє ідентифікувати кишкові бактеріальні спільноти комах з високою роздільною здатністю та точністю. В якості основного субстрату в експериментах використовували 13-мічену глюкозою.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Купуйте або отримуйте яйця кладок Spodoptera littoralis у власного вирощувального закладу. Витримуйте їх у стерильних чашках Петрі при кімнатній температурі (RT) до вилуплення.
2. Підготуйте штучне вигодовування для вирощування комах наступним чином:
   1. Замочіть 500 г меленої білої квасолі на ніч у 100 мл води.
   2. Додайте 9,0 г аскорбінової кислоти та 75 г агару до 1000 мл дистильованої H 2 O, а потім закип’ятіть.
   3. Дайте суміші охолонути і коли вона застигне (до білої воскоподібної твердої суміші) зберігайте при температурі 4 ° C до використання.
3. Перенесіть щойно вилупилися личинок у чисту пластикову банку та покладіть їх на систему штучного вигодовування при 23-25 ​​° C при тривалому дні з 16-годинним режимом освітлення та 8-годинною темрявою. Міняйте їжу щодня, поки личинки не пройдуть усі шість личинкових стадій.

2. 13 С маркування ДНК у метаболічно активних кишкових бактерій

1. Розчиніть 186,1 мг повністю 13-міченої глюкози з дистильованою та деіонізованою водою (ddH 2 O) і добре змішайте зі 100 г штучної їжі для експерименту SIP. Забезпечте остаточну концентрацію глюкози 13 С 10 мМ у штучному вигодовуванні. Це імітує концентрацію глюкози in situ в кишечнику личинок S. littoralis на рослинах бавовни згідно з Shao et al. (подано).
2. Близько 9-15 здорових другій личинки від ящика для вирощування до стерильних пластикових чашок Петрі (одна личинка на чашку Петрі) зі свіжою 13 С-глюкозою, змішаною зі штучним харчуванням. Штучне харчування з такою ж кількістю самородної глюкози (12 С-глюкози), як описано для годування контрольної групи.
3. Часто поновлюйте штучне вигодовування під час інкубаційного періоду (1 день). Використовуйте умови вирощування, як на кроці 1.3.
4. Зібрати дев’ять личинок з кожної обробки для подальшої обробки (вилучення ДНК). Кожна копія складається з трьох людей, які роблять щонайменше три повторення за одну процедуру.

4. Вилучення та ампліфікація ДНК

6. Характеристика ДНК шляхом піросеквенування

7. Аналіз даних піросеквенування

1. Проаналізуйте необроблені сегменти послідовності, генеровані піросеквенуванням 454, використовуючи "Кількісні уявлення про екологію мікроорганізмів", програмне забезпечення QIIME 26. Виконайте обробку наступним чином:
   1. Спочатку перетворіть sff-файл, створений машиною 454, у файли FASTA, QUAL та Flowgram за допомогою process_sff.py сценарій.
   2. Підтвердьте файл зіставлення (на основі check_id_map.py) і призначити мультиплексні зчитування біологічному насінню за допомогою split_libraries.py Сценарій. Виріжте низькоякісні кінці з розміром розсувного вікна 50 та середнім рівнем якості 25, навіть усуньте неоднозначні короткі послідовності (необхідна довжина передплати. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

   Репрезентативні результати

   Після ультрацентрифугування, як тільки кількість ДНК, що відокремлюється в кожній фракції, підтверджена і проведено вимірювання щільності, побудуйте графік середньої щільності фракції в г/мл над числом фракції, щоб визначити правильне формування нахилу в пробірках, що зазвичай включає діапазон щільності підтвердження від 1,690 (для фракції 12 або 11) до 1,760 г/мл г/мл (для фракції 1). Кількісне піросеквенування проводиться безпосередньо на репрезентативному градієнті SIP для виявлення видів ліній та відносної чисельності (Малюнок 2 ). Тут ми проаналізували важкі фракції як зразка, модифікованого 13 C-глюкозою, так і немеченого контролю, який служив для профілювання активних популяцій у спільноті. Після секвенування загалом було сформовано 120 045 високоякісних зчитувань із середньою довжиною 404 нуклеотидів. Профіль піросеквенування показав підвищену частоту деяких видів, включаючи Enterococcus та Pantoea, у міченій пробі (13 Д-мічена ДНК, Рис.3) порівняно з контрольною групою (12 С контрольної ДНК, Малюнок 3). Отже, бактерії слід вважати метаболічно активними і заслуговують на подальше вивчення.

   
   1. 13 експеримент з годуванням С-глюкозою, екстракція ДНК та ампліфікація ПЛР гена 16S рРНК E. (A) 13 C-глюкозо-модифіковане штучне вигодовування, яке вживають личинки Spodoptera littoralis. (Б) Тубільці Глюкоза (12 С-глюкоза) перетворилася на штучне вигодовування личинок з тієї ж партії комах (A) використовується, що служить споживаним контролем . (C) Типовий екстракт ДНК метагеному з кишкової тканини личинок у групі, яка отримувала 13 препаратів, що лікували С-глюкозу, і 12 - у контрольній групі С-глюкози. Три біологічні копії (смуги 1, 2 і 3) включені в кожну групу. М означає маркер ДНК 1 кб. (D) ПЛР-ампліфікація за допомогою універсального набору бактеріальних праймерів генерує правильні продукти гена 16S рРНК 1,5 кб, використовуючи вилучену метагеномну ДНК як шаблон. Доріжка 1 є ПЛР-позитивним контролем. Доріжки 2 і 3 встановлюють 13 зразків, оброблених глюкозою, і 12 зразків контролю цукру. jpg "target =" _blank "> Клацніть тут, щоб збільшити його.
   
   2. Розробка експерименту Pyro-SIP з градієнтом щільності щільності CsCl ультрацентрифугуванням та фракцією з піросеквенсуючою характеристикою відокремленої ДНК. H = більша чисельність, L = менша чисельність та чисельність. Клацніть тут для більшого перегляду .
   
   3. Бактеріальне різноманіття та відносна кількість у важких фракціях природних личинок, що годуються глюкозою (12 C-контрольна ДНК), і 13 личинок, що годуються C-глюкозою (13-мічена ДНК)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Клацніть тут, щоб збільшити.

   Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

   Обговорення

   У сукупності описаний тут протокол забезпечує простий, швидкий та ефективний метод визначення метаболічної активності кишкової флори, який можна додатково застосовувати для оцінки конкретної ролі симбіонтів Бакенріала у харчуванні, детоксикації та захисті господаря.

   Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

   ---