Ідентифікація MyoD-інтерактому за допомогою тандемного афінного очищення в поєднанні з мас-спектрометрією

Анотація

Вступ

MyoD вважається головним гравцем у спрацьовуванні термінальної диференціації м’язів 9, оскільки він має здатність викликати міогенну програму детермінації/диференціації (транс-диференціації) у багатьох повністю диференційованих нем’язових системах 10-13. Дійсно, примусова експресія MyoD індукує транс-диференціацію різних типів клітин, навіть тих, що походять з іншого ембріологічного походження 12. Наприклад, MyoD може перетворювати гепатоцити, фібробласти, меланоцити, нейробласти та адипоцити в подібні м’язові клітини. Трансдиференційована дія MyoD передбачає аномальну активацію міогенної генетичної програми (зокрема, її цільових генів) у нем’язовому середовищі, одночасно із замовчуванням вихідної генетичної програми (зокрема, генів проліферації).

При проліферації міобластів MyoD експресується, але не в змозі активувати цільові гени, навіть коли він зв'язується з їх промоторами 14-16. Отже, вимога MyoD щодо постійної експресії в недиференційованих міобластах залишається досить невловимою. MyoD зміг придушити цільові гени завдяки набору репресивних ферментів, що модифікують хроматин, у проліферацію міобластів до завантаження, щоб активувати ферменти ремоделювання хроматину 14,17. Наприклад, при проліферації міобластів MyoD асоціюється з транскрипційним ко-репресором KAP-1, гістоновими деацетилазами (HDAC) та лізином, що репресує метилтрансферази (Kmts), включаючи гістон H3 лізин 9 або H3K9 та H3K27 Kmts і активно пригнічує експресію цільові гени шляхом встановлення місцево репресивної структури хроматину 14,17. Що важливо, нещодавній звіт показав, що сам MyoD безпосередньо метилюється H3K9 KMT G9a, що призводить до гальмування його трансактиваційної активності 16.

Епігенетичні механізми, що беруть участь у цій трансдиференціації нем’язових клітин за допомогою MyoD, в основному невідомі. Зокрема, певні клітинні лінії стійкі до індукованої MyoD-транс-диференціації. Таким чином, у клітинах HeLa MyoD неактивний або навіть може функціонувати як репресор, а не як активатор транскрипції через відсутність експресії субодиниці BAF60C в комплексному ремоделюванні хроматину SWI/SNF 18. Вибір для кращої характеристики механізмів репресії генів індукований MyoD. Він також підходить для тестування здатності MyoD індукувати репресивне середовище хроматину в його цільових локусах разом із асоційованими партнерами, а отже, виявляти залежні від MyoD репресивні механізми в проліферації міобластів для вдосконалення термінальної диференціації.

Тут ми описуємо протокол для ідентифікації партнерів MyoD за допомогою тандемної аффінної очистки (TAP-Tag) у поєднанні з характеристикою мас-спектрометрії (MS). Використання клітин HeLa, стабільно експресуючих S3 Flag-HA MyoD, забезпечило достатньо матеріалу для очищення комплексів MyoD від фракціонованих ядерних екстрактів. Визначення партнерів MyoD у гетерологічній системі супроводжувалось валідацією у відповідній системі.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Приготування ядерних фракцій HeLa-S3, що екстрагуються соллю та хроматином

2. Комплекси очищення білка

Примітка: Виконайте паралельні витяги з кожної клітинної лінії (HeLa-S3 Flag-HA-MyoD та контроль, Hela-S3 Flag-HA).

3. Аналіз мас-спектрометрії

Примітка: Наступні кроки слід обговорити з установкою з спектрометрія з маса, яка буде виконувати аналіз.

  1. Додайте 3/4 (22,5 мкл) зразків 7,5 мкл 4x завантажувального буфера і 3,3 мкл 10-кратного відновника і кип’ятіть протягом 5 хв при 96 ° C.
  2. Наносять зразки на SDS-поліакриламід 4-12% гелю. гель Працюйте при постійній напрузі 150 В протягом 5 хвилин, щоб весь білок потрапив у гель без відділення.
  3. Змити гель водою; зафіксувати протягом 20 - 30 хв розчином фіксатора (10% оцтової кислоти, 50% метанолу, 40% ультрачистої води), потім змити закріплений гель 5 разів в надчистій воді.
  4. Виріжте смужки, що містять білки, зберігайте в 1 мл води в пробірці об'ємом 1,5 мл і відправляйте в установку мас-спектрометрії.

Аналіз 4. Дані

Примітка: Це загальне керівництво для аналізу. Точні кроки залежать від конкретного режиму даних, наданих установкою MSвикористовується для проведення аналізу (наприклад, 21,22).

  1. Порівняйте список білків, ідентифікованих в елюатах "MyoD", зі списком, отриманим із відповідного препарату негативного контролю. Виключити з аналізу білки, присутні в обох списках.
  2. Видаліть білки, що мають ≤2 загальної кількості ідентифікованих пептидів, із решти списку.
  3. Отримайте доступ до функціональної анотації та функціональної класифікації отриманого списку білків із використанням ресурсів DAVID Bioinformatics (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) та класифікуйте список білків 23,24.
  4. (Необов’язково) Вилучити зі списку "автостопів", завантажені неядерні білки з сильною негативно зарядженою ДНК-адвентицією 25. Вони містять цитоскелетні, цитоплазматичні, мітохондріальні, мембранні та рецепторні білки (згортання білків, цитоскелета та білків різних груп таблиці 1 і 2).
  5. Порівняйте отримані списки взаємодій MyoD з фракціями SE та NE, щоб визначити специфічні загальні білки та білки для кожної фракції (Малюнок 2).

5. Підтвердження взаємодії, визначеної Western Blot

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Щоб зрозуміти регуляцію активності MyoD, ми провели вичерпну характеристику комплексів MyoD за допомогою біохімічного очищення, заснованого на імуноочищенні подвійної міченої форми MyoD з подальшою мас-спектрометрією (MS). Використання HeLa-S3, що експресує мічену Flag-HA мічену клітинну лінію MyoD, і контрольну клітинну лінію, що експресують Flag-HA, дозволили отримати достатню кількість матеріалу для очищення комплексу MyoD шляхом проведення подвійного спорідненого очищення Flag-HA -MyoD.

Клітинні екстракти фракціонують на цитоплазматичну та ядерну фракції, потім додатково фракціонують ядерну фракцію видобутої солі (ядерно екстрагується сіль, SE) і збагачуються нуклеосомами (NE нуклеосома, збагачена фракціями). Очищення TAP-Tag від цих відокремлених ядерних фракцій (рисунок 1, таблиці 1 і 2) дозволено розплутувати партнерів, які мають відносно низький рівень чисельності, коли вони локалізовані в певному ядерному відсіку. Крім того, така стратегія була використана для виявлення партнерів незв’язаного (SE) проти ДНК (NE) MyoD, щоб отримати уявлення про регуляцію активності MyoD.

Для очищення TAP-Tag була використана система епітопів Flag tandem-HA. Невеликий гідрофільний прапор і епітопи HA мають мінімальний вплив на функцію білка і дуже доступні для взаємодії антитіло-антиген. Проводили послідовну імуноочищення на основі смол Anti-Flag та анти-HA, з подальшим элюированием імуноочищених комплексів за допомогою пептидів Flag і HA. Потім елюйовані білки запускали на SDS-PAGE, щоб всі білки могли потрапити в гель. Шматочки гелю, що містять усі очищені білки, вирізали; білки екстрагували, перетравлювали трипсин та ідентифікували за допомогою мас-спектрометрії (МС).

Як видно на малюнок 2, Очищені від N-фракції комплекси MyoD мають більш високе збагачення факторів транскрипції та ко-репресорів. Аналіз MS розкрив низку відомих партнерів MyoD (таких як Pbx, Id, E12/E47 (HTF4), BRG1 (SMCA4), MEIS1.) Та нових партнерів, що було підтверджено в дослідженнях, створених цим аналізом (таких як HP1, CBF, MBD3, BAF47 (SNF5/INI1) та всі інші складні субодиниці SWI/SNF.) (Малюнки 2 і 3) 26-28. Це підкреслює можливих партнерів MyoD, пов’язаних з ДНК, та ко-регуляторів, які можуть створити репресивно-хроматинове середовище. Наприклад, білки HP1, які були визначені партнерами MyoD за описаною методологією, як відомо, зв’язують метильований H3K9 для підтримки репресії генів та структури гетерохроматину. Дійсно, MyoD HP1 інгібує транскрипційну активність, що виникає внаслідок експресії зміненого цільового гена MyoD і кінцевої диференціації м'язів 26.

Подальше фракціонування комплексів MyoD SE та NE градієнта гліцерину (як описано в 29) виявило підмножини MyoD у двох під'ядерних компартментах. (малюнок 1B). Зокрема, SE MyoD розподіляється у трьох підгрупах, тоді як пов'язаний хроматином MyoD в основному належить до одного комплексу.

Частина виявлених TAP-міток/МС взаємодіючих речовин підтверджена вестерн-блот на комплексах MyoD. Сюди входять фактор транскрипції CBF, EBB, MTG8R та субодиниця BAF47 SWI/SNF (SNF5) (малюнок 3A, в ліворуч) і білки HP1 (CBX1 та CBX3) (малюнок 3A, в право). Важливо, що оскільки клітини HeLa не є м’язовими клітинами і не відображають MyoD, існує потреба підтвердити взаємодію між нещодавно виявленими взаємодіючими та MyoD у міобластах. (рисунок 3 BD). Зокрема, для такої валідації загальних ядерних екстрактів (без поділу на SE та NE), як правило, достатньо, що дозволяє зменшити кількість міобластів, що використовуються для приготування зразків. Тести взаємодії in vitro, як у 26,27, допомагають додатково підтвердити ці висновки. Нарешті, функціональне значення цих взаємодій у м’язових клітинах слід додатково розглянути, як у 26-28.

У сукупності представлені дані показують цілісний погляд на всюдисущих партнерів MyoD і відкривають шлях для подальших функціональних досліджень у більш релевантній моделі м’язів.

допомогою
Рисунок 1: Комплекси MyoD, виділені тандемним очищенням за спорідненістю (список А) __GVirt_NP_NN_NNPS 37. Авторське право Американське товариство з біохімії та молекулярної біології. Ця цифра була змінена з 26: тепер показані смуги з макетними очищеннями та складними eMyoD, виділеними з ядерних фракцій Південної Європи. (B) Комплекси eMyoD, очищені подвійною спорідненістю, як у (AT) були фракціоновані на градієнт гліцерину в діапазоні від 20% до 41%. Фракції збирали вручну, концентрували та аналізували вестерн-блот (WB), використовуючи анти-флаг-антитіла. Зверніть увагу на наявність декількох eMyoD, що містять підкомплекси ядерної фракції, що піддаються видобутку солі (SE). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Малюнок 2:. Порівняння зв’язаний хроматин (збагачена нуклеосома, NE) проти Ядерно розчинна (ядерна сіль, що добувається, SE) MyoD Partners Вгорі: Діаграма Венна, що показує перекриття між взаємодіючими елементами eMyoD, виділеними з ядерної солі, що добувається (SE), та збагаченою нуклеосомою (NE) фракцією. Рибосомні білки, фактори ініціювання трансляції, фактори відновлення ДНК та ізоформи тубуліну були виключені з аналізу, оскільки вони присутні в різних різних наборах даних, отриманих TAP, і вважаються неспецифічними. Взаємодіючі речовини MyoD, знайдені як у SE, так і в NE (загальні) або специфічні фракції для однієї з (унікальних) фракцій, були розділені на групи на основі їх функціональних анотацій. Зв’язаний цитоскелет та інші різні білки не показані. Підкреслені білки - це взаємодії MyoD, підтверджені або в HeLa, та/або в міобластах спільного імунопреципітації. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Дошка 1:. Список білків, ідентифікованих за допомогою MS-аналізу в ізольованих очищених подвійних споріднених комплексах eMyoD в З фракції, що добувається ядерною сіллю, після віднімання фонових білків (Білки, виявлені MS в елюатах з контрольної клітинної лінії, вважалися фоновими неспецифічними.) Дані представляють суму чотирьох незалежних очищень. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Таблиця 2: Білковий список IНевизначено за допомогою MS-аналізу в eMyoD-очищених подвійних споріднених комплексах, виділених із збагаченої нуклеосомної фракції після фонової субтракції білка. Дані представляють суму трьох незалежних очищень. Натисніть тут, щоб завантажити цей файл.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Як зазначалося вище, клітини HeLa природним чином не експресують фактор транскрипції м’язів MyoD. Тому було важливо підтвердити взаємодії, виявлені в моделі скелетних м’язів (рисунок 3). Багато звітів підтверджують у відповідних моделях такі функціональні взаємодії між MyoD та деякими партнерами, виявленими у представленому тесті TAP-тегу. Це, наприклад, випадок з прохібітином 33, DDX17 34, Meis1 35, CBF 27, HP1 26 та комплексом ремоделювання хроматину SWI/SNF 36,28,30.

Зауважимо, що можна виконати таку TAP-мітку очищення невеликої кількості клітин, таких як міобласти, у поєднанні зі сприйнятливою РС. Дійсно, нещодавня стаття описує характеристику партнера MyoD після індуцибельної експресії MyoD, що мітить прапор у міобластах 30. Оскільки стабільна та тривала надмірна експресія MyoD у міобластах шкідлива, альтернативним підходом буде додавання міток Flag-HA у міобласти. Алель (и) MyoD у міобластах із використанням методів редагування геному, таких як CRISPR-cas9 31. Слід зазначити, що додавання мітки може міняти функцію та/або асоціацію білків із з’єднанням, тому розташування маяка (N - або С-термінал) слід вибирати з обережністю. Функціональний аналіз злитого білка в ураженій системі слід провести перед очищенням TAP-мітки, щоб переконатися, що мічений білок функціонує. Імунопреципітація ендогенних білків дозволяє уникнути цих проблем, однак вона покладається на наявність специфічного антитіла з високою спорідненістю, яке рідко доступне.

Ще однією доданою цінністю описаного підходу є можливість виявлення посттрансляційних модифікацій (PTM) самого очищеного білка та його рясних партнерів. Таким чином, за допомогою цієї функціональної можливості очищення TAP-мітки підходить для виявлення не тільки нових партнерів по взаємодії, але і нових ферментативних функцій, пов'язаних з цікавим білком та/або його партнерами. У разі білка, що зв’язує хроматин (наприклад, фактори транскрипції, ферменти), цей метод, таким чином, придатний для ідентифікації асоційованого «гістонового коду». Це пояснюється тим, що аміно-кінцеві хвости гістону, які оголюються на поверхні нуклеосоми, піддаються дії кількох ковалентних ПТМ. Гістони PTM надають унікальний підпис задіяним нуклеосомам. Таким чином, комбінація різних модифікацій хвостів N-кінцевих гістонів може модифікувати структуру хроматину, щоб забезпечити регулювання експресії генів. Таким чином, характеристика модифікацій, пов’язаних із даним білком, може дати розуміння ролей та механізмів дії досліджуваних білків, що зв’язують хроматин 22.

Таким чином, представлена ​​методологія дозволяє повністю ідентифікувати партнерів MyoD. Очищення TAP-міток забезпечує альтернативу іншим підходам, таким як випадаючий TPS, двогібридні аналізи дріжджів та показ фагів. Незважаючи на те, що з практичних міркувань (отримання великої кількості ядерних екстрактів) нам доводиться використовувати гетерологічну клітинну систему, нам вдалося підтвердити причетність ідентифікованих партнерів MyoD до диференціації скелетних м'язів. Отримані дані показують, що міогенний фактор MyoD, здається, взаємодіє з безліччю білків, починаючи від регуляторів транскрипції і закінчуючи зв'язуванням РНК-білків, що свідчить про різні механізми, що регулюють активність фактора транскрипції.

На закінчення, той самий методологічний підхід може бути використаний для виявлення всюдисущих партнерів багатьох ядерних факторів, які може бути важко вивчити в їх конкретному клітинному контексті.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.