Імуномагнітне розділення протоколу Sca1high, отриманого з жирових клітин, специфічного для жирового депо (ASC)

Вступ

У галузі ожиріння та діабету фіброз тканин та запалення відіграють вирішальну роль у розвитку та підтримці діабету 2 типу. Нещодавно Токунага та ін. показали, що з пахових ізольованих висококлітинних Sca1 (або підшкірних, SQ) та перигонадальних (або вісцеральних, VIS) 10 різних генних сигнатур та ECM, що відновлює in vitro жирові відкладення C57BL6/J. MMP14 (MT1-MMP), прототиповий член сімейства матрикс-мембрано-металопротеїнази (MMP) мембрани, опосередковує розвиток білої жирової тканини (WAT) завдяки своїй колагенолітичній активності 1.

Приклади експериментів, які можна провести з клітинами за наступним протоколом, включають тривимірну культуру, дослідження диференціації, аналізи деградації колагену та виділення та збагачення послідовності РНК 10,11. Аналізи деградації слід проводити з екстрагованим кислотою колагеном для забезпечення збереження телопептиду 11,12. Наступний протокол продемонструє методи виділення судинної строми первинних клітин з різних жирових відкладень та збагачення їх у клітини-попередники адипоцитів за допомогою імуномагнітного поділу клітин. Дійсність сортування клітин може бути оцінена за допомогою проточної цитометрії та за допомогою Sca1-GFP - мишей, які експресують GFP в клітинах Sca1 +, загнаних промотором Sca1 13.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Заява з питань етики: Комітет з використання та догляду за тваринами Університету Мічигану (UCUCA) затвердив усі методи та протоколи відповідно до керівництва з догляду та використання лабораторних тварин (Інститут лабораторних досліджень тварин, Національна наукова рада). Мишей поселяють у віварії Університету Мічигану, їм надають вільний доступ до їжі та води та утримують протягом 12 годин циклу світло/темрява.

2. Виділення підшкірних (SQ) жирових подушечок

  1. Евтаназію миші передозуйте ізофлураном та пневмотораксом.
  2. Акуратно обприскайте мишу 70% етанолом і покладіть на спину. Закріпіть лапи на поролоновій дошці голками 22 г.
  3. Зробіть невеликий виріз на шкірі живота. Тримаючи кінчики розрізу щипцями, візьміть ножиці та відокремте шкіру перед тим, як відокремлювати очеревину.
  4. Як тільки шкіра відокремлюється від очеревини від живота до грудної клітки, шкіра дзеркально відображається від очеревини у напрямку до голови через бічні порізи на шкірі вздовж боку тіла.
  5. Віддзеркаліть шкіру, що залишилася в паху, утримуючи жир від вашого тіла і прикріпіть до пластини голками 22 г.
  6. Перейдіть на дрібні ножиці та пінцет. Візьміть пахову жирову прокладку щипцями біля початку очеревини і відріжте між шкірою та паховим жиром у напрямку до паху, просуваючись, уникаючи SQ від забруднення шкіри.
  7. Помістіть ізольовану пахвинну жирову прокладку у призначений лоток на 60 мм.

3. Виділення вісцеральних (ВІС) жирових прокладок

  1. Подібно до кроку 2.5, розріжте очеревину, щоб розкрити вісцеральний жир і добре.
  2. Відсуньте кишечник у бік грудної клітки.
  3. Візьміть жирову прокладку VIS на дистальний кінець і обережно потягніть її вгору. Розсічіть жирову прокладку ВІС, обережно виключаючи епідидимальну (або маткову, якщо використовуються самки мишей) тканини.
  4. Помістіть у лоток для етикеток і повторіть крок 3.3 для решти панелі VIS.

4. Колагеназне перетравлення жирових відкладень

6. Перевірка імуномагнітного поділу високих САУ Sca1 за допомогою проточної цитометрії

  1. Промийте клітини двічі HBSS (-Ca, -Mg) і дисоціюйте клітини, використовуючи 0,05% трипсину.
  2. Клітини центрифугують при 300 xg протягом 5 хв. Ресуспендують клітини в 1 мл культурального середовища і підраховують лічильну камеру.
  3. Отримують> 10 6 клітин у 1 мл культурального середовища та центрифугують при 300 g протягом 5 хв.
  4. Видаліть супернатант і повторіть крок 6.3 ще два рази.
  5. Клітини з 1 мл 2% козячої сироватки + 2% BSA і блокують протягом 30 хв при RT.
  6. Клітини центрифугують при 300 xg протягом 5 хв.
  7. Видаліть заблокований розчин.
  8. Додайте щурячий IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400) або анти-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 мкг, 1: 400), в 100 мкг. l PBS з 2% козячої сироватки та 2% BSA + PBS при 4 ° C протягом 30 хв у темряві.
  9. Додайте до клітин 1 мл холодного PBS. Центрифуга 300 xg протягом 5 хв при 4 ° C.
  10. Видаліть супернатант і повторіть крок 6.9 ще два рази.
  11. Клітини в 1 мл PBS. Пропустіть суспензію клітин через 100 мкл. m Клітинне сито для підготовки до проточного цитометричного аналізу.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Скупчення Sca1 високого ASCS з різних жирових прокладок.

Судинні стромальні клітини, виділені з жиру SQ, мають фібробластоподібну витягнуту форму клітини незалежно від рівня експресії Sca1 (Малюнок 1А). З іншого боку, VIS (похідні EWAT) Sca1 високі та Sca1 низькі клітини демонструють помітні відмінності у формі їх клітин. Як і високі клітини Sca1 SQ (похідні iWAT), високі клітини VIS (похідні EWAT) Sca1 мають видовжену фібробластоподібну форму клітин, тоді як низькі клітини VIS Sca1 мають епітеліоїдну форму. Високі клітини SCA1, виділені з мишей SCA1-GFP, легко ідентифікуються як GFP-позитивні клітини в культурі тканин (1В) ідентифіковані. Коли ці клітини оцінювали за допомогою цитометрії, більшість GFP позитивних клітин підтвердили експресію білків Sca1 на клітинній поверхні, як виявлено за допомогою антитіла Ti-Sca1 (1С). Високі клітини Sca1, отримані з пахових жирових прокладок, підтримують здатність адипоцитів - диференціація зростає, тоді як високі клітини Sca1, отримані від EWAT, важче розрізнити за допомогою звичайних 10 адипогенних сумішей в адипоцитах.

Експресія генів, що залежать від жирового депо, з високим ASCS Sca1 (Малюнок 2).

Загальногеномні аналізи транскриптомів із секвенуванням РНК показали збагачення генів у зв'язку з білками та модифікаторами позаклітинного матриксу (GO: 0,031.012, GO: 0005578) у цих Sca1 високих ASCS 10. У зв'язку з аналізом ПЛР у реальному часі ми змогли виявити різні Вираз колагенолітичних MMP (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) між iWAT- та EWAT, отриманими Sca1, щоб продемонструвати високий ASCS. Коли використовували мічені флуоресценцією колагенові гелі типу I, щоб оцінити перицелюлярну деградаційну активність, ми спостерігали значно підвищену активність ремоделювання колагену, опосередковану VIS Sca1 з високим ASCS 10.

протоколу
Рисунок 1: Імуномагнітне розділення мишачого Sca1 високе ASCS з різних жирових відкладень (A) Sca1 високий і Sca1 низький ASCS, ізольовані від SQ (iWAT) та VIS (EWAT). Шкала = 100 мкм м. (B) Клітини Sca1-GFP, виділені iWAT від мишей Sca-GFP. Шкала = 100 мкм м. (C) Експресію клітинної поверхні Sca1 у Sca1-GFP-позитивних клітинах оцінювали за допомогою проточної цитометрії. (Ліворуч) контрольні антитіла до ScaG IgG (праворуч) анти-Sca1. Вісь X, інтенсивність GFP. Вісь Y, Alexa-Fluor 647. Панель A, раніше показана у Tokunaga, M. et al., (2014) .ig1large.jpg "target =" _ blank "> Будь ласка, натисніть тут, щоб побачити більшу версію цього малюнка.

протоколу
Малюнок 2:. Експресія колагенолітичних ММР, ТІМП та колагенів, що залежить від жирового депо (A) Диференціальна експресія генів ECM та модифікаторів ECM у високому ASCS Sca1, виділеному з різних жирових відкладень. (B) підвищена активність деградації колагену VIS (похідного EWAT) Sca1 з високим ASCS. Розщеплення колагену показано як зникнення флуоресцентних сигналів (стрілки та наконечники стрілок). Вставка - це збільшене зображення сфокусованого розпаду колагену, опосередкованого однією клітиною SQ ASCS. Клітини культивували протягом 72 годин. Дані, наведені раніше у Tokunaga, M. et al., (2014). Натисніть тут, щоб ПЕРЕГЛЯНУТИ більшу версію цього малюнка.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Тут ми продемонструємо ізоляцію та імуномагнітне відділення клітин мишачого ASCS від різних жирових прокладок та їх використання для експериментів in vitro. Представлений метод ефективний для швидкої ізоляції великої кількості Sca1-позитивних ASCS, що вигідно порівняно з технічно складною та дорогою FACS-опосередкованою ізоляцією ASCS 9,14. На відміну від FACS, імуномагнітне поділ клітин не дозволяє використовувати множинні антигени для ідентифікації популяції клітин-мішеней. Проте, якщо поверхневий антиген добре охарактеризований, використання імуномагнітного поділу збільшує кількість клітин, не покладаючись на використання пристроїв FACS 15, які все ще недоступні в невеликих інститутах без основних установ для аналізу багатьох біологічних дослідників .

Хоча Sca1 не зустрічається в геномі людини, ідентифікація та перевірка альтернативних антигенів клітинної поверхні на жирових депо-залежних стовбурових клітинах жирової тканини людини виражається до 17, у поєднанні з цією методикою поділу клітин, може допомогти нам визначити біологію стовбурових клітин жирової тканини людини.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Авторам нічого розкривати.

Подяка

Ця робота підтримується NIH DK095137 (THC). Ми вдячні нинішнім та колишнім членам лабораторії, які сприяли розробці та вдосконаленню описаних процедур.