Індукція атеросклеротичних бляшок за допомогою активації рецепторів мінералокортикоїдів у
Резюме
Ми описуємо протокол індукування атеросклерозу в корінцях аорти мишей ApoE -/-, які харчуються атерогенною дієтою шляхом безперервного вивільнення альдостерону. Також описані методи характеристики складу нальоту.
Анотація
Вступ
Кілька досліджень показали, що альдостерон бере участь у розвитку атеросклерозу 8, 9, 10. Інфузія альдостерону на мишах ApoE -/-, які харчуються атерогенною дієтою, прискорює розвиток атеросклеротичних уражень, що викликають запалення кореня аорти та утворення багатих ліпідами бляшок - 10 .
Підсумовуючи, ми описуємо протокол, що включає інфузію альдостерону, атерогенне дієтичне харчування, вбудовування серцевої тканини, кількісну оцінку та характеристику атеросклеротичних уражень у мишей ApoE -/-. Ця процедура сприяє ефективному утворенню запалених, багатих ліпідами атеросклеротичних бляшок і представляє цінну модель для вивчення атерогенезу.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Дослідження фінансувалось Італійським національним комітетом з питань охорони здоров’я та використання, дозвіл № 493/2016-PR. Всі процедури проводились відповідно до настанов Європейського Співтовариства щодо використання лабораторних тварин (Керівництво ЄС 2010/63/UE).
Примітка: Підшкірна імплантація осмотичного міні-насоса транспортним засобом (етанол у фізіологічному розчині) або альдостероном (240 мкг · кг -1 · д -1) у мишей-самців 8-10 тижнів, неадекватних гену ApoE. Взагалі, самці мишей ApoE -/- 8-10 тижнів важать приблизно 25-26 г.
- Розчиніть 5 мг порошку альдостерону в 1 мл абсолютного етанолу.
- 68,3 мкл сольового розчину Додати 56,7 мкл альдостерону (розчиненого в етанолі), щоб отримати концентрацію 2,27 мкг/мкл. заповніть повністю осмотичний міні-насос повністю 125 мкл цього розчину (максимальна потужність кожного міні-насоса становить 125 мкл).
- Використовуйте швидкість потоку міні-насоса 0,11 мкл/год; Отже, кожні 24 години виділяють 2,64 мкл розчину.Дайте кожній миші приблизно 6 мкг · д -1 альдостерону протягом 28 днів.
(2) наповнення та імплантація осмотичного насоса
Примітка: Насоси бувають двох окремих частин: основної частини насоса та регулятора витрати.
3. розсічення серця
4. Виріжте з коріння аорти зрізи
ПРИМІТКА: Усі етапи фарбування, про які повідомляється в наступних протоколах, виконуються в кюветах для фарбування скла Coplin.
(6) Аналіз зображень атеросклеротичних уражень на ділянках кореня аорти
Примітка: Зрізи коренів аорти, пофарбовані Масляним червоним O або MAC3 або цікавим антитілом, можуть бути оброблені за допомогою відповідного програмного забезпечення (інформація в Таблиця матеріалів) для аналізу. Загальне піксельне фарбування, позитивне для цікавить компонента, нормується до загальної площі нальоту. Зображення збирав та аналізував сліпий слідчий лікування.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Через 8-10 тижнів мишей Apo -/- імплантували для інфузії носієм або альдостероном (рис. 1Е-1І) і годували атерогенною дієтою (з коригованою калорійністю 42% жиру) протягом 4 тижнів. В кінці лікування мишей евтаназували і перфузували PBS з 10% формаліном, як описано вище. Корінь аорти відокремився від верхівкової частини серця і був вбудований в ОАТ (рис.2). Поперечні зрізи коренів аорти були готові до різного фарбування за допомогою кріостатичного апарату (рис.3).
Склад атеросклеротичного нальоту може характеризуватися фарбуванням певних компонентів, що визначають стадію розвитку нальоту. Масляне червоне фарбування O використовується для визначення вмісту жиру в атеросклеротичних ураженнях, як описано на кроці 5.1, червоне фарбування Picro Sirius використовується для визначення вмісту колагену, як описано на кроці 5.2, а фарбування Mac3 використовується для вимірювання вмісту макрофагів, описаних на етапі 5.3. Після 4 тижнів лікування мишами альдостерону спостерігалося значне збільшення ліпідів (рис. 4А-4 С) та вміст макрофагів (рисунок 4-4F), що виявляється в атеросклеротичних бляшках на рівні кореня аорти, але відмінностей у вмісті колагену не спостерігається (рис. 4-4I) порівняно з мишами, обробленими за допомогою транспортного засобу. Дійсно, у цій моделі альдостерон прискорює атерогенез, викликаючи запалення судин, але не фіброз (Рисунок 4).
Ілюстрація 1: Підготовка та імплантація осмотичного міні-насоса транспортним засобом або альдостероном. ВІД) Кроки для наповнення осмотичних міні насосів транспортним засобом або альдостероном. В) Кроки для закриття корпусу насоса регулятором витрати. D-F) Етапи створення розрізу для імплантації насоса на тильній стороні миші. G-me) Імплантація осмотичного міні-насоса і зшивання розрізу. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Малюнок 2: Підготуйтеся вставити і вирізати серце та корінь аорти. ВІД) серце розрізане поперечно вздовж прямої лінії, що з’єднує нижні точки правого та лівого передсердь. Верхівкова частина серця обробляється для кількісного визначення складу атеросклеротичного ураження в корені аорти. В) корінь аорти зсередини серця. D-E) Серцева порожнина заповнена жовтнем. F) Орієнтація серця у розсіченій формі, попередньо заповненій OCT (з порожниною серця до дна форми) G) Заморожування розсіченого серця за допомогою ОКТ у формі. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Атеросклероз - це хронічне запальне захворювання, яке вражає великі та середні судини із взаємодією між різними типами клітин, такими як B. Макрофаги, Т-лімфоцити, ендотеліальні клітини та клітини гладких м’язів призначаються клітинам 1. Незважаючи на обмеження мишачих атерогенних моделей, існує безліч доказів про атеросклеротичний процес. Ці моделі мають перевагу у швидкому формуванні експериментальних когорт певного віку та статі. Миші також демонструють визначений і однорідний генетичний фон.
Розвиток атеросклеротичних бляшок, що спостерігається на мишачих моделях, сприйнятливих до артеріосклерозу, частково нагадує добровольців, за винятком нестабільного утворення бляшок 4, що спостерігається. На мишачих атерогенних моделях не спостерігалося розриву нальоту та тромбозу, що є основною причиною інфаркту міокарда у людей. У наших публікаціях ми показали, що інфузія альдостерону для індукції нестабільного фенотипу бляшок у мишей ApoE -/-, які годували HFD-10 через 4 тижні. Насправді, це лікування може збільшити наліт, вміст жиру та рівень запальної зони кореня аорти без істотної різниці порівняно з необробленими мишами 10 вмістом колагену. Зверніть увагу, що у цих мишей спостерігається посилений розвиток атеросклерозу, незалежного від гіпертензії, враховуючи, що лікування альдостероном 10 артеріального тиску суттєво не змінювалося.
У цьому рукописі ми детально показуємо технічну процедуру вбудовування серцевої тканини в жовтні та послідовні етапи, тобто H. Виріжте корінь аорти та проаналізуйте наліт. Порівняно з парафіном, OCT забезпечує підготовку зрізів з високим діапазоном товщини (1-100 мкм) з мікротомом кріостата та мінімальною обробкою тканин. Обмеження можуть також впливати на якість замороженої тканини, що потенційно впливає на утворення кристалів льоду, а також змінює субклітинні деталі та виробляє артефакти, виявлені за допомогою імуногістологічного фарбування. Насправді вважається, що кріоконсервація краще зберігає антиген та антигенність. Насправді заморожена тканина зберігає структуру антигенів. Обробка замороженої тканини для імуногістохімії також дозволяє уникати використання формаліну, який є токсичною та канцерогенною речовиною,.
Повідомлення Коли з’являються три клапани, найкраще розрізати тканину різної товщини залежно від типу аналізу, що проводиться. Насправді, деякі слайди використовуються для визначення прогресування нальоту, тоді як решта слайдів можна використовувати для різних плям (наприклад, Picro Sirius, Mac3 тощо).
Атеросклеротичні ураження у мишей, які отримували альдостерон, багаті на ліпіди, а макрофаги характеризуються використанням Олійно-червоного O (для фарбування ліпідів), Mac3 (для фарбування макрофагів), Sirius red (для фарбування колагену) або інших специфічних антитіл, що цікавлять Білки. Важливо підкреслити, що вбудовування ОКТ, на відміну від вкладання парафіну, уникає використання органічних розчинників, які видаляють вміст ліпідів у місцях ураження. Тому фарбування ліпідів олійно-червоним O можливо в секціях, вбудованих в ОСТ, і вміст жиру в атеросклеротичних бляшках може бути точно визначений.
У цьому рукописі ми показали, що інфузія альдостерону є цінним методом сприяння розвитку атеросклерозу у мишей ApoE -/-. Згідно з даними, інфузія альдостерону на мишах ApoE -/- здатна: 1) збільшити активацію ендотеліальних клітин, представлену посиленою експресією молекул, що беруть участь у адгезії та міграції моноцитів на ранніх стадіях утворення атеросклеротичного нальоту 12, 13; та 2) вміст ліпідів та прозапальних макрофагів для збільшення стадії кореня аорти 10, 13. Ці ефекти не зумовлені гемодинамічними ефектами альдостерону 10. Підсумовуючи, запропонований протокол забезпечує дійсний метод генерування та характеристики атеросклерозу у мишей; Це могло б контролювати ранні стадії захворювання та результати терапевтичного втручання та реабілітації при атеросклерозі.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.